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人工设计蛋白质及其突变体的折叠性质研究

韩敏捷  
【摘要】:蛋白质的折叠协同性是指蛋白质在折叠或在行使功能时表现出折叠和解折叠两种状态。大量的实验证实天然发生的小蛋白质多数会表现折叠协同性,许多学者也因此认为协同性的出现是蛋白质稳定存在和功能的发挥的必要条件。近些年来,随着蛋白质设计理论和平台的改善,人工从头设计的蛋白质可以像天然蛋白质一样稳定存在和表现功能,却不表现出协同性。人工设计的蛋白质与天然蛋白质唯一的区别是前者未经过自然选择的过程,因此我们大胆的猜想,协同性的出现也许与自然选择有关,是自然选择赋予的结果,而与其稳定性和功能无关。因此在本文中,我们就以此作为研究起点展开工作。我们以从头设计的蛋白质E_1r26,D_1cy5_M1,xim5,Rim5A(ABCUS设计平台)等为起始蛋白质,采用序列退化的方案展开研究。采用将蛋白质的折叠性与氯化铬抗性偶联的筛选体系,在维持抗性的基础上,用大引物全质粒法建立突变体库,迭代筛选,对每一轮突变体测序分析,选定一些突变体进行蛋白质表达纯化和理化性质分析,包括HSQC、热变性/化学变性圆二色谱(Circular Dichriosm,CD)、差示扫描量热(Differential Scanning Calorimetry,DSC)和差示扫描荧光法(Difference Scanning Fluorescence,DSF)。实验结果表明,α+β结构的突变体E_1r26108的核磁共振谱HSQC谱峰基本可以与起始蛋白质E_1r26重合且谱峰均一。变性CD曲线呈S型,这与我们的设计模板硫氧还蛋白质(PDB ID 1R26)的变性曲线一致。DSC和DSF实验表明,突变体E_1r26 108与1R26蛋白质有着相似的变性过程和变性温度(Tm),而且变性温度都要远低于起始蛋白质E_1r26。另一个突变体E_1r26 1003212,表型出协同性的折叠过程,但是二级结构和三级结构已经处在稳定的边缘。全α螺旋结构突变体D_1cy5_M1 100425在变性CD上表现出协同性,同时稳定性显著降低。热动力学实验与最小抑制浓度(MIC,Minimal Inhibitory Concentration)实验结果显示随着筛选轮数的增加,突变体稳定性降低,第三轮时变体表现出显著的抗性降低特征,实验表明:经过退化筛选的过程,蛋白质的序列经历了最有序到有序,再到无序的过程。实验结果表明,在维持蛋白质三级结构的基础上,采用序列退化策略,实现了序列从最有序到无序的退化过程,在退化过程中氨基酸序列会经过序列相对有序的区域,该区域的蛋白质即可以正确的折叠又能够表现出折叠协同性。而退化超出此区域,虽然协同性存在,但是稳定性较差。因此我们猜测也许协同性的出现并不是蛋白质稳定性存在的必然条件,也许是因为有了自然选择才有此结果。本研究工作也许能给予蛋白质设计者一些启示,即设计蛋白质时并不一定要把蛋白质是否有协同性作为设计成功的一个必要参考条件。


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