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禽类Ii基因的克隆、表达及其功能的初步研究

仲大莲  
【摘要】:Ii链是一种非多态性的Ⅱ型跨膜蛋白,在调节MHC Ⅱ类分子的表达和功能方面发挥重要作用。人类和小鼠的Ii基因都是单拷贝基因,其mRNA都能够以不同的拼接模式产生不同形式的Ii链异构体。但是禽类Ii链是否存在异构体还未见报道。我们利用RT-PCR和RACE的方法确定了两个鸡Ii链cDNA,并且用Southern blotting、Northern blotting和免疫荧光法分别检测了Ii基因的拷贝数、mRNA表达和蛋白表达情况。被命名为鸡Ii-1的cDNA长为1,151bp,含有一个由672bp组成的开放阅读框,它与一个已经被报道的鸡Ii链序列相一致;另一个Ii链cDNA被命名为鸡Ii-2,其大小为1,337bp,含有一个由861bp组成的开放阅读框。Ii-1与Ii-2在核苷酸和氨基酸水平上的同源性均为99%,两者的区别在于Ii-2比Ii-1多出一个Tg区。Southern blotting结果表明,这两个cDNA由一个单拷贝的基因产生。Northern blotting结果表明,Ii-1和Ii-2在6周龄鸡的脾脏和法氏囊中高表达,而在胸腺、心脏和肝脏中有Ii-1低水平表达,但未检测到Ii-2的表达;在鸡胚胎的晚期发育中,两种Ii链异构体在脾脏和法氏囊中均被检测到高水平表达。脾组织切片的免疫荧光染色结果表明,Ii链主要表达在细胞膜上。这些资料表明,鸡Ii链存在两种异构体,它们由mRNA的选择性拼接产生,并且主要在免疫器官中高表达。 利用一对自行设计的简并引物,通过RT-PCR和RACE方法,我们获得了鸭Ii链cDNA,并将其命名为鸭Ii-1。Ii-1长为1,190bp,含有一个41bp的5′不翻译区、一个669bp的开放阅读框和一个480bp的3′不翻译区。鸭Ii链也存在编码含有Tg区的异构体,我们将其命名为鸭Ii-2。鸭Ii-1与鸡Ii-1氨基酸序列的同源性为82%,与哺乳动物Ii P31/P33之间的同源性约为60%。鸭Ii-2 Tg区与鸡Ii-2Tg区在氨基酸水平上的相似性高达96%,与哺乳动物Ii链Tg区之间也达到70%。利用一对能同时扩增鸭Ii链两种异构体的引物,通过半定量RT-PCR检测不同组织Ii mRNA的分布情况,结果表明,Ii链两种异构体在不同组织中广泛表达,尤其在脾脏和法氏囊中高水平表达。应用comparative protein modeling分析了鸭Ii链三聚体区和Tg区的三维结构,它们与人Ii链相应domain的结构完全相似。这些结果表明鸭Ii链也存在两种异构体,它们主要在免疫器官中高表达,并且


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