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蛋白CMS SH3结构域溶液结构的测定及其与c-Cbl C-末端多肽相互作用的研究

姚波  
【摘要】:本论文工作的重点是与人类疾病相关的蛋白质的结构域的克隆表达及结构、功能的研究。我们克隆,表达和纯化了人源蛋白质CMS N端的第二个SH3结构域(CMS_SH3_B),并用NMR的方法测定了这个结构域的溶液结构。同时通过Biacore和NMR化学干扰实验研究CMS_SH3_B与来自c-Cb1 C-末端多肽(Cb1-p)的结合作用。我们第一次给出了CMS_SH3_B水溶性结构,并通过NMR化学位移干扰和Biacore试验第一次确定c-Cb1 C末端肽段701-712参与了c-Cb1与CMS的相互作用。我们给出了CMS_SH3_B与Cb1-p相互作用的结合模型。所有这些结果都有利于CMS功能进一步的研究。 第一章是蛋白质CMS的研究背景和功能简介。CMS(Cas ligand witn multiple Src homology 3 domians)是一种信号转导途径中的衔接蛋白质(adaptor protein)。它最初是在酵母双杂交实验中作为p130~(cas)的结合蛋白质被发现的。CMS自身有很多可以与其他蛋白质相互作用的结合位点,通常可以与其他蛋白质形成更加复杂的蛋白质复合物,这就是使得CMS在信号转导途径中通常是以脚手架蛋白质(scaffolding protein)的角色出现,从而调控细胞的生长,分化,繁殖,迁移以及凋亡。这些结构特点是CMS行使生化功能的基础。 在第二章中,我们使用NMR波谱技术测定了CMS_H3_B的溶液结构。CMS在N-末端有三个SH3结构域,这些结构域是CMS与其它蛋白质作用的结合区域。在这三个SH3结构域中,第二个与第三个SH3结构域序列同源性为48.2%,而第一个和第二个SH3结构域的序列同源性为42%。因此,第二个和第三个SH3结构在功能上可能更为相似。已有文献报导CMS与c-Cb1的相互作用是通过其第二个SH3结构域结合到c-Cb1的C-末端上,我们研究的重点放在CMS第二个SH3结构域上。通过分子克隆技术,编码CMS_SH3_B的基因在大肠杆菌中得到了克隆和表达。然后利用Ni离子亲和层析法,这个重组蛋白质的纯度可以达到90%以上。最后使用异核三维核磁共振的方法,CMS_SH3_B的三维溶液结构得到了精确的测


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