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霍山石斛多糖干预小鼠亚急性酒精性肝损伤的蛋白质组学及代谢组学研究

王晓玉  
【摘要】:背景与目的: 长期或大量饮酒所导致的酒精性肝损伤是世界范围内引发肝脏疾病及相关疾病的一个主要原因,严重威胁人类的生命健康。鉴于饮酒的普遍性和潜在危害性,从食源性资源中寻找能够有效预防酒精性肝损伤的功能因子,开展其保肝作用机理研究,对开发保肝功能食品以预防酒精性肝损伤的发生将具有十分重要的意义。 食源性多糖DHP (Dendrobium huoshanense polysaccharides)是从可食植物霍山石斛(Dendrobium huoshanense Tang et Cheng)中提取分离纯化而获得的有效活性部位,具有抗氧化降血糖、增强机体免疫力等作用,并具有调节肝功能活性。 本论文将以小鼠亚急性酒精性肝损伤为模型,口服灌胃霍山石斛多糖DHP,在评价DHP对小鼠亚急性酒精性肝损伤保护功效的基础上,通过对比乙醇处理小鼠和DHP+乙醇处理小鼠的肝脏差异性蛋白质谱以及血清和肝脏的代谢产物谱,筛选DHP发挥保肝作用的蛋白质和小分子代谢产物,并通过生物信息学方法挖掘可能的DHP干预亚急性酒精性肝损伤作用的特异性靶蛋白和靶分子,建立相应的预测性生物分子相互作用网络,探讨DHP干预亚急性酒精性肝损伤的分子机制,以期为基于霍山石斛开发抗酒精性肝损伤的功能因子和功能食品提供理论依据。 方法: 1、亚急性酒精性肝损伤小鼠模型建立及DHP的干预:96只健康雄性昆明种小鼠随机分为正常组,模型组,DHP组(100,200,400mg/kg),DHP完全水解物组(200mg/kg),淀粉组(200mg/kg),阳性对照水飞蓟素组(50mg/kg),每组12只。各给药组预先灌胃给予相应药物预防30d后,各给药组和模型组通过灌胃给予30%乙,醇(2400mg/kg bw)连续15d诱导亚急性酒精性肝损伤,各给药组继续给药15d。实验期间,正常组灌胃给予等量溶媒。 2、DHP保护亚急性酒精性肝损伤的功能评价:观察小鼠体重变化、肝指数,测定血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性,血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、总胆红素(TBIL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)及尿酸(UA)水平、同时进行肝脏病理学检查。其中,血清中ALT及AST采用速率法;血清TC采用酶法(COD-PAP法);血清TG采用酶法(GPO-PAP法);血清LDL和HDL采用匀相测定法;血清TBIL采用改良J-G法;血清尿酸(UA)采用酶比色法;肝脏病理学变化采用HE染色法光镜下观测。 3、蛋白质组学分析:应用双向荧光差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE)技术分析DHP干预亚急性酒精性肝损伤小鼠肝脏组织蛋白表达谱变化,获得差异蛋白质点信息;运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight/time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-TOF)技术鉴定差异显著的蛋白质点,并对选定的差异蛋白进行Western blot验证。 4、代谢组学分析:采用超高压液相色谱-轨道离子阱质谱联用(UHPLC-LTQ Orbitrap XL MS)技术分析DHP干预亚急性酒精性肝损伤小鼠的血清及肝脏组织样本,获取血清和肝脏组织的代谢轮廓,采用模式识别方法结合非参数检验对数据进行分析,寻找血清及肝脏组织中的差异代谢物。 5、生物信息学分析:运用生物通路分析工具[PA (Ingenuity Pathway Analysis)分析蛋白质组学和代谢物组学的实验数据,搜索相关基因、蛋白质、小分子代谢物的信息,并建立多层次的生物分子相互作用网络。 结果: 1、肝功能指标分析表明,与模型组相比,DHP各剂量组可改善小鼠一般状况,降低明显增加的肝指数(P0.01、P0.01、P0.01), DHP(200,400mg/kg)组可降低血清中过高的AST水平(P0.05,P0.01)TBIL水平(P0.05、P0.05)和UA水平(P0.01、P0.05);DHP (400mg/kg)组还可降低小鼠血清升高的TC水平(P0.05)和LDL水平(P0.05)。病理检查显示,与亚急性酒精性肝损伤模型组比较,DHP各剂量组小鼠肝脏脂肪变性和炎症明显减轻。这些结果提示:DHP对小鼠亚急性酒精性肝损伤的具有保护作用 2、2D-DIGE分析发现,与正常组相比,模型组共筛选出18个显著差异表达的蛋白质点(9个表达上调,9个表达下调);与模型组相比,DHP (400mg/kg)组共筛选出7个显著差异表达的蛋白质点(4个表达上调,3个表达下调)。经过MALDI-TOF-TOF成功鉴定出18个蛋白质点,涉及17种蛋白质,它们分别是转铁蛋白(Tr),胱硫醚β合成酶(Cbs),乳酸脱氢酶D (Ldhd),蛋羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶2(Hmgcs2),S腺苷甲硫氨酸合成酶(Matla),角蛋白8(Krt8),乙酰辅酶A乙酰基转移酶2(Acat2),果糖二磷酸醛缩酶B (Aldob), Tatd脱氧核糖核酸酶域1(Tatdn1),乙二醛酶结构域蛋白4(Glod4),酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氧酶铁-硫蛋白3(Ndufs3),氨甲酰磷酸合成酶1(Cpsl),果糖-1,6-二磷酸酶(Fbp1),碳酸酐酶3(Car3),三磷酸鸟苷结合蛋白SARla (Sarla),谷胱甘肽巯基转移酶P1(Gstpl),腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Aprt)。经蛋白质组学服务器ExPASy及UniProtKB分析,上述蛋白涉及糖代谢、氨基酸代谢、脂类代谢、能量代谢、核苷酸代谢、氧化应激等。以Cbs、Matla和Ldhd为代表的Western blot验证结果显示,差异表达蛋白的变化趋势与2D-DIGE蛋白质组分析结果基本一致。 3、联合UHPLC-LTQ Orbitrap XL MS技术及SIMCA-P11.0软件分析了模型组与正常组、DHP (400mg/kg)组与模型组的小鼠血清及肝脏组织代谢谱的差异。结果表明:①与正常组相比,模型组血清中有35个代谢物发生显著改变,主要涉及氨基酸类、甘油磷脂类、鞘脂类、前列腺素类、白三烯类、嘌呤类、脂肪酸代谢衍生物、碳水化合物类等;肝脏组织中有11个代谢物发生显著改变,主要涉及维生素类、甘油磷脂类、脂酰胺类、前列腺素类和有机磷酸酯类,其中胆碱磷酸和磷脂酰胆碱PC(13:0)在小鼠血清和肝脏中均具有相同的变化趋势,它们可能是酒精性肝损伤较为特征的潜在生物标志物。②与模型组相比,DHP (400mg/kg)组血清中有16个代谢物发生显著改变,主要涉及氨基酸类、甘油磷脂类、肉碱类、类固醇类、脂酰胺类、肽类和硝基喹啉类;肝脏组织中有3个代谢物即胆碱磷酸、溶血性磷脂酰胆碱LysoPC (20:3)乙酰磷酸发生显著改变,其中DHP可显著下调模型组中升高的血清L-脯氨酸和肉毒碱水平。 4、通过IPA软件分析得到了DHP干预亚急性酒精性肝损伤的差异蛋白相互作用网络和小分子代谢物相互作用网络。 结论: 1、DHP (200,400mg/kg)可不同程度保护酒精对小鼠肝脏损伤,对亚急性酒精性肝损伤具有良好的预防干预效果。 2、蛋白质组学研究揭示DHP是通过多靶点对亚急性酒精性肝损伤进行干预,其中包括对MG途径和甲硫氨酸途径的调节。 3、代谢组学研究揭示DHP主要在脂肪酸代谢途径、甘油磷脂代谢途径、氨基酸代谢途径、细胞色素P450代谢途径上调节亚急性酒精性肝损伤小鼠血清和肝脏组织中的小分子代谢物变化。 4、由蛋白质组学和代谢组学发现的差异蛋白质和小分子代谢产物为DHP抗亚急性酒精性肝损伤的功效提供了分子层面的证据,为进一步研究DHP干预亚急性酒精性肝损伤的作用机制奠定了基础并指引了方向。


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