基于功能核酸探针的铜离子检测新方法的研究

【摘要】：随着社会工业发展,工业污染日益严重,特别是在重金属的处理方面还存在很多缺陷。工业废水的随意排放,化学农药的肆意使用,均可对环境造成严重的污染。在自然环境中,重金属污染日益严重,特别是铜离子,它所造成的危害大大影响着生态平衡,而日常生活中的铜超标更是会带来很多安全隐患。因此实现对铜离子的定量检测具有重要的研究意义,可以大大降低人体摄入过量铜离子的概率。本文基于核酸功能探针建立了两种方法对铜离子检测展开了研究:(1)基于功能核酸DNAzyme的免疫侧向层析技术铜离子检测方法的建立本方法的建立基于DNAzyme对Cu~(2+)的特异性识别与PCR扩增技术结合的基本原理。DNAzyme识别结合Cu~(2+)之后,激活其切割活性,使得DNAzyme的底物链发生断裂掉落。利用磁性吸附将切割片段富集,作为PCR扩增的模板进行指数级扩增,增加切割片段的浓度,提高实验方法的灵敏度。扩增产物上标记有生物素和FITC,利用链霉亲和素和生物素之间的特异性结合与抗原抗体反应,试纸条上C、T线可以识别并牢牢捕获相应的抗原与复合物,实现目标物的可视化检测。该实验方法在最佳实验条件下检测目标物Cu~(2+),特异性良好,检测限为0.024 n M,线性范围为0.01 n M～1.5 n M(R~2=0.99019)。(2)基于功能核酸DNAzyme和回文序列组装技术铜离子检测方法的建立本方法的建立基于DNAzyme对Cu~(2+)的特异性识别与核酸杂交技术结合的基本原理。根据实验需求设计相应的探针,基于回文序列的独特性,通过碱基互补配对完成核酸长链的组装。DNAzyme识别结合Cu~(2+)之后,切割活性被激活,底物链被切割。由于DNAzyme上的底物链和酶链分别标记有荧光基团FAM和淬灭基团Dabcyl,底物链的切割片段掉落,荧光基团与淬灭基团分离,反应体系中荧光恢复,实现目标物的定量检测。最佳实验条件下检测目标物Cu~(2+),特异性良好,检测限为0.67 nM,线性范围为0.1 nM～100 nM(R~2=0.99779)。