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微生物转化植物甾醇制备甾体药物关键中间体研究

杨英  
【摘要】: 甾体激素类药物是临床上不可缺少的一类重要药物。雄甾-4-烯-3,17-二酮(Androst-4-ene-3,17-dione,简称:雄烯二酮或AD)是甾体激素类药物不可替代的中间体,对机体起着非常重要的调节作用,可以说几乎所有甾体激素类药物都是以其作为起始原料进行生产的。目前,国内外对甾体药物的需求量很大,所以,AD具有广阔的市场前景。 本文研究微生物转化植物甾醇制备AD关键技术。主要研究以植物甾醇为原料,通过微生物转化技术将甾醇边链选择性切除制备AD的一种主要方法。结论如下: (1)生物转化法生产AD还未实现大规模工业化生产的主要原因之一是AD转化率低。以Mycobacterium sp.BD696为出发菌株,分别采用UV照射,60C o照射,UV+60 C o复合诱变处理筛选获得一株高转化率突变株Mycobacterium sp-UC-8,其产生AD的能力较出发菌株提高了39.2%,且不再产生结构类似副产物雄二烯二酮(ADD),传至第五代产率仍较为稳定,展示UV+60 C o复合诱变是遗传育种的一种有效方法。结合生产的实际情况,建立了微生物转化植物甾醇为AD的检测方法:先用TLC薄层层析法分析,后有选择性的进行气相色谱检测。 (2)针对底物疏水性问题,对分枝杆菌在双水相转化系统中生产AD工艺作了一系列研究。研究了高聚物/无机盐双水相系统、高聚物/高聚物双水相系统对转化的影响;同时研究了高聚物/高聚物总浓度对甾醇转化的影响。试验结果表明:不同高聚物组成的双水相系统都可以满足将甾醇转化为AD的要求,而且明显比在高聚物与无机盐双水相系统中转化率高:总浓度20%时转化率较高,且PEG10000和DEX20000的浓度分别为12%和8%时,转化率达到了50%左右,较浓度均为10%时提高了5%:研究了双水相体系中不同缓冲液、不同初始pH值对转化的影响,研究表明:pH值对转化率影响很大,pH为8.0~8.5,利于甾醇向AD转化,其中磷酸缓冲液中pH 8.5,最高转化率达到50.1%,且没有ADD生成;pH在4.0~6.5时利于甾醇向ADD转化,柠檬酸缓冲液中,pH5.5时ADD最高转化率达到15.9%。 (3)研究了双液相系统中,植物甾醇微生物转化制备AD的工艺以及底物投料量、表面活性剂和添加酶制剂对降解的影响。结果表明:葵花油是分枝杆菌降解甾醇生成AD的最佳有机溶剂,底物投料量、添加羟化酶抑制剂对转化有一定的影响。通过正交试验,确定了葵花油/水系统最优转化条件:葵花油浓度为20%,底物投料量为0.4%,添加剂为0.005%氯化汞,此工艺条件下,AD转化率高达83.4%。 (4)研究了分枝杆菌Mycobacterium SP-UC-8利用植物甾醇生产AD的机理,考查了酶抑制剂、促进剂、诱导剂对转化得率及生物量的影响。结果表明:添加低浓度诱导剂甾醇可提高AD产量,当菌种生长12h时加入诱导剂,添加量为0.15g/L时脱氢酶活力最高,此时AD含量为2.46g/L,转化率为84.2%,发酵周期由168h缩短到144h;低浓度ZnSO4.7H2O对酶活性具有促进作用,浓度为0.1g/L时AD含量达到2.50g/L, ZnSO4.7H2O浓度上升到0.3g/L后,ZnSO4.7H2O对△3-脱氢酶活性产生抑制作用,导致AD产量明显降低;9a羟化酶抑制剂HgCl2可以抑制AD的进一步降解,使AD的产率上升了3.4%,但对菌体消耗多糖及生物量的影响不大。 (5)通过单因素实验,均匀实验设计及响应面法分析对培养基成分进行了优化。得到最优培养基成分为:废糖蜜58.4925mL/L,葵花油211.6283 mL/L,甾醇6.0119g/L,硝酸氨3.2 g/L,磷酸氢二氨0.8 g/L,氯化汞0.055 g/L。在此条件下,AD产量达到2.5486g/L,且重复性试验结果较好。根据中心组合设计原理,通过SAS(?) Systemfor Windows 9.0对葵花油、废糖蜜、甾醇三个因素进行响应面分析,拟合出响应面及等高线图;建立了葵花油,废糖蜜,甾醇三因素五水平的响应面回归模型,并对模型经过失拟、F和t检验,证明该模型在该试验条件下能反映生物转化植物甾醇过程的内部规律。分析了三因素和双因素及交互作用对AD转化率的影响,比较分析了各因素对转化率影响大小:依次为废糖蜜葵花油甾醇;甾醇和废糖蜜、废糖蜜与葵花油均存在交互作用但影响不显著,葵花油与甾醇之间存在显著的交互作用。 (6)对分枝杆菌的转化条件进行了优化。得到了最佳转化条件:温度为30℃,摇床转速为220r/min,接种量为10%,初始pH为8.2。研究了转化过程中pH的变化规律。试验发现pH在5-9较宽的范围内,分枝杆菌仍然能够生长、存活。表明当环境pH值(简称pHout)变化时,为了保护细胞,微生物有一套控制细胞内pH(简称pHin)的系统,这些pHin调控系统包括细胞质缓冲物质、酸或碱物质及通过离子泵向胞外运输H+,这样其pHin仍然维持中性或接近中性范围内。 (7)研究了分枝杆菌的菌体生长、基质消耗及产物生成的特征,基于Logistic方程、Leudeking-piret方程,建立了描述分批发酵过程的动力学模型及模型参数,对实验数据与模型进行了验证比较,平均相对误差均小于7%,模型计算值与试验数据拟合良好,基本反映了分枝杆菌分批发酵过程的动力学特征,表现出很好的适用性。运用MATLAB软件进行非线性曲线拟合,得参数a=0.2320,β=0.0007,均不等于零,证明产物的生成与细胞生长属部分偶联型;在此基础上进行了5L-5000L发酵罐逐级工艺放大,为产业化设计和生产提供了可靠的依据。 (8)研究从双水相系统发酵液油相分离提取AD的新方法。重点对浓缩过程中NaCl添加量、静置时间、萃取比等操作参数进行了优化选择。结果表明:添加70g/L的NaCl,静置8h,用乙醇以1.5:1(v/v)的萃取比萃取,浓缩效果达到最好。实验确定了AD精制工艺,制备的精品AD干燥失重=0.5%、熔点168~173℃、比旋度检测+193°~+202°,含量94.5%(HPLC),达到AD企业质量标准。


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