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保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶合成共轭亚油酸研究

郑钰  
【摘要】: 共轭亚油酸(Conjugatede linoleic acid, CLA)是具有共轭双键的18个碳原子的不饱和脂肪酸。CLA具有一系列的位置和几何异构体,其中c9,t11-CLA和t10,c12-CLA两种异构体被认为最具有生物活性,研究发现这两种异构体具有抗肿瘤、抗粥样动脉硬化、减肥、免疫调节、抗糖尿病等功能。共轭亚油酸天然存在较少,主要靠人工合成,生物法合成共轭亚油酸具有反应条件温和,异构体成分单一的优点,可用于食品和药品的添加,而亚油酸异构酶做为合成中的重要酶近年来成为研究的热点。 本文以保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶为研究对象,首先在产物分析鉴定的基础上,对保加利亚乳杆菌诱导产酶条件进行了研究,其次研究酶的分离纯化条件和酶学性质,并对酶的反应体系进行了初步研究。 气质联用色谱和液相色谱检测结果表明:保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶可以合成CLA,其中含有两种异构体,主要产物为c9,t11-CLA. 诱导产酶条件研究表明,在脱脂乳培养基中添加1.5‰(v/v)LA所产酶的共轭亚油酸转化率最高;温度为36℃,培养36h为较适的培养条件;单独添加0.1%(m/v)的乳糖或0.1%(m/v)的氯化钠有利于诱导产酶;在培养基中直接添加LA的效果优于培养3至12h后再进行添加。 亚油酸异构酶的最佳提取条件为,以0.7%(m/v)的量添加溶菌酶(30℃,1h),然后在冰水浴中超声破碎(超声3S,间歇4S,90次,功率400W)。粗酶液经过40~80%饱和度的硫酸铵进行盐析,millipore超滤管进行超滤,SephadexG-100凝胶过滤层析的步骤进行分离纯化后,酶的纯化倍数达到5.17倍,比活力为244.78[U/mg]。纯化后的亚油酸异构酶在SDS-PAGE电泳中只有一条条带,达到电泳纯度,分子量为42.69KDa。 亚油酸异构酶的酶学特性表明:保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶的最适反应温度为40℃,在20-40℃范围内酶有较高的稳定性;最适反应pH值为4.0,pH值在3.0~6.0范围内有较高的稳定性;低浓度(0.01mol/L)的金属离子Ca2+,Zn2+, Mg2+可利于亚油酸异构酶的催化反应,其影响顺序分别为Ca2+Zn2+Mg2+;高浓度(0.02mol/L)的SDS有利于亚油酸异构酶的纯化反应;以亚油酸为底物的酶促反应动力学方程得到,Km=3.87mmol/L, Vmax=4.35mmol/mL·h。 亚油酸异构酶反应体系初步研究表明:保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶在缓冲液体系下CLA转化率最高;正己烷适合为亚油酸异构酶非水体系反应的介质;微水体系在正己烷中添加0.6%的缓冲液的反应体系亚油酸异构酶的CLA转化率较高;在两相体系中正己烷与缓冲液的配比为6:4时,亚油酸异构酶的CLA转化率较高;乙醇不适合做为均相体系的介质。


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