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花生肽的酶法制备、分离纯化及其抗氧化活性研究

孟凡莉  
【摘要】: 我国花生资源非常丰富,花生蛋白质具有较高的营养价值,含有人体必须的八种氨基酸。目前,结合低温冷榨花生饼粕加工,花生脱脂蛋白资源开发功能肽成为研究热点,本文通过蛋白酶在温和的条件下水解花生蛋白而获得的花生抗氧化肽。 本文利用花生脱脂蛋白为原料,采用胰蛋白酶、风味酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和碱性蛋白酶水解,进行花生分离蛋白的酶解试验,与温度、反应时间、酶与底物质量比(酶底比)、底物浓度(w/v)、pH等因素均对酶解液水解度(DH)和多肽得率(TCA-NSI)产生影响。在此基础上,筛选出碱性蛋白酶和风味酶为工具酶。为优化碱性蛋白酶和风味酶酶解花生蛋白的工艺条件,通过正交旋转组合建立了短肽得率及水解度与各影响因素的回归模型;结合实际生产确定了碱性蛋白酶酶解花生蛋白的最佳参数组合为:温度为55℃、pH值8.4、底物浓度为4.31%、酶底比为3.39%、水解时间4h。在此条件下,花生多肽得率为74.88%,水解度为23.40%。风味酶酶解花生蛋白的最适参数组合为:温度59.30℃、pH值7.45、底物浓度为5.60%、酶底比为5.03%、时间2h。在此条件下,花生多肽得率为77.17%,水解度为22.84%。 在碱性蛋白酶和风味酶的酶解最适条件下,水解时间分别为15,30,60,90,120,150,180min。然后研究不同水解度水解物的抗氧化活性。研究表明,两种酶解物都显示出较强的还原能力、抗氧化能力、清除自由基的能力。且随着时间的延长,水解度和还原能力、抗氧化能力、清除自由基的能力逐渐增强,碱性蛋白酶水解物抗氧化活性高于风味蛋白酶。两种酶解液的抗氧化活性都随着浓度的增加而增强,且在一定浓度条件下,碱性蛋白酶酶解液抗氧化活性强于风味酶酶解液。 采用截留分子量8K Da、3.5K Da、1K Da的透析袋对花生蛋白酶水解液进行分级分离。不同蛋白酶解物配制相同的浓度,样品分子量范围在1K Da以下的多肽混合物的含量分别为碱性蛋白酶和风味酶的总水解物的76.21%和83.42%。不同分子量范围的水解物均具有一定的清除羟基自由基的能力。其清除自由基程度随分子量的减小而增大。分子量范围在1K Da以下的组分清除自由基的能力最强。其清除率分别为78.49%和67.83%。碱性蛋白酶水解物小于1K Da组分的自由基的清除率高于风味蛋白酶。Tricine-SDS-PAGE电泳图谱表明,透析袋分级效果明显,三分级组分在分子量上明显小于未水解的花生蛋白,且三者的分子量分布呈现递减趋势。 经过葡聚糖凝胶层析Sephadex G-25、葡聚糖凝胶层析Sephadex G-15分离技术,从花生蛋白的碱性蛋白酶水解液和风味蛋白酶水解液小于1K Da组分中分别分离出了抗氧化活性较高的组分J22和F22,其相应的自由基清除率分别为85.16%和76.83%。氨基酸分析表明:J22、F22和花生分离蛋白相比,组成氨基酸种类发生了变化,花生分离蛋白中含有15种氨基酸,而J22和F22中含有9种氨基酸。花生分离蛋白中未检测出甘氨酸,而在J22和F22组分中未检测出谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸,同时半胱氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、酪氨酸和组氨酸百分含量高于花生分离蛋白中的百分含量。对于高活性的J22和F22组分别通过高效液相和质谱分析表明:经凝胶柱分离的单一组分仍然是由分子量不同的许多肽组成的混合物,其分子量主要分布在200~400 Da,根据氨基酸的平均分子量为128,由此可推断J22和F22组分是由2至3个氨基酸组成的小肽。


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