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福寿螺多糖的提取及抗乙肝病毒实验研究

赵东贤  
【摘要】:目的:研究福寿螺多糖提取工艺以及其体内外抗乙肝病毒的作用。方法:在多糖提取实验中,采用碱浸醇沉法,以多糖含量为指标,利用正交试验法对提取过程中的醇沉浓度、浸提温度、浸提酸碱度及浸提时间4个因素进行优选研究。并将提取的福寿螺多糖分离、除杂、备用。在体外实验中,以HBV-DNA克隆转染人肝癌细胞(HepG2)的2.2.15细胞系为细胞模型,采用MTT比色法检测福寿多糖对HepG2.2.15细胞生长的抑制作用。在其安全浓度范围内,选择含有五种不同浓度的福寿螺多糖及阳性对照药物3TC的培养基,对此细胞系进行培养。每3d更换相同培养基,第9d收集细胞培养上清液,同时设阴性对照组。采用时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)法检测HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的水平;以实时荧光定量PCR技术检测培养液中的HBV-DNA含量。以此综合评价福寿螺多糖体外抗乙肝病毒的活性作用。在体内实验中,以转基因小鼠为动物模型,随机分为5组(每组8只):福寿螺多糖低、中、高3个剂量组,拉米呋啶组和阴性对照组,腹腔注射给药,观察用药前与用药后5d、10d、15d、20d及停药后5d小鼠HBV-DNA的表达,从而评价福寿螺多糖体内抗HBV作用。结果:优化的多糖提取工艺为:加无水酒精至醇沉浓度为75%、溶液的pH=9.0、浸提温度50℃、浸提时间8h。体外实验结果表明福寿螺多糖在1mg·mL-1浓度以下对细胞无毒性;在5个浓度下,对HBsAg、HBeAg均有抑制作用,最大抑制率分别为50.57%和21.12%;对HBsAg的治疗指数为12.35;对HBV-DNA的复制也有一定的抑制作用(P0.05),但抑制效果不及3TC。体内实验结果表明福寿螺多糖中、高剂量组在给药第15、20d,低剂量组在给药第20d, HBV-DNA拷贝量对比给药前均有下降,有显著性差异(1)P0.05,2)p0.01)。但各剂量组福寿螺多糖的抑制率低于同时段的拉米呋啶对照组,也具有显著差异性(7)P0.05)。高剂量组在停药5d后HBV-DNA抑制率为15.76%与拉米呋啶组相比无差异性。结论:优化的福寿螺多糖提取工艺经济,有效,可行。福寿螺多糖在体内外具有一定的抗HBV作用,毒副作用小,安全范围大。 图[7]表[9]参[76]


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