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亮菌漆酶的发酵生产、酶学性质及应用基础研究

杨丽红  
【摘要】:漆酶(Laccase, EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,作用底物广泛,具有重要的工业价值。本文以亮菌作为产漆酶的出发菌,对亮菌漆酶的发酵生产、分离纯化、酶学性质及应用进行研究,主要结果如下: 以发酵液中的亮菌胞外漆酶酶活力为试验指标,采用正交试验法对亮菌液体发酵产漆酶的培养基和培养条件进行优化筛选。结果表明,最佳培养基碳氮源组合为葡萄糖0.5%、淀粉1.5%、硫酸铵0.2%、酵母浸膏1.5%,在此条件下亮菌漆酶酶活力达4.97U/ml;最佳培养条件为装液量75ml、接种量6%、菌龄7d、培养时间10d,在此条件下亮菌漆酶酶活力达5.35U/ml;在最优培养条件下添加愈创木酚等诱导剂,漆酶酶活力最高达7.84U/ml。综合比较,亮菌漆酶的酶活力随着发酵条件的改善在逐渐提高,但提高幅度极小,最高酶活力仍不理想。以几种中药渣和麦麸为主料,采用单因素试验和正交试验的方法对亮菌进行固体发酵,几种中药渣以白芍药渣为碳源产漆酶最佳,并且其最适培养条件为葡萄糖0.9%,白芍麸皮比例3:7,温度25℃,含水量65%,接种量11%,在优化培养条件后,漆酶酶活力较初始培养基提高了19倍。 亮菌固体发酵后粗酶液经过硫酸铵盐析、DEAE-cellulose柱层析,活力回收率为26.7%,得到电泳纯的亮菌漆酶,SDS-PAGE法证实其分子量约为55.4kD。亮菌漆酶最适反应温度为55℃、最适反应pH为4.0,在pH4.5的偏酸性环境中,酶活力较高,活性较稳定。酸根阴离子和金属阳离子对酶活力都有不同程度的影响,高浓度的阴离子对漆酶酶活力影响较大,尤其试验中高浓度的CO32-影响最大;高浓度的Cu2+能明显降低漆酶酶活力,而Na+和Mg2+对漆酶的酶活力影响不大。 初步研究亮菌漆酶粗酶液降解氯酚类物质的能力,结果表明,亮菌漆酶能有效降解2,4-二氯苯酚、2-氯苯酚、4-氯苯酚,在最适条件下,2,4-二氯苯酚、2-氯苯酚、4-氯苯酚的降解率分别为95.6%、85.7、83%,在氯酚类污染物降解和环境保护方面具有潜在的应用价值。


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