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β-苯丙氨酸变位酶基因工程菌的构建及其产酶条件优化

唐尧  
【摘要】:β-苯丙氨酸变位酶属于MIO-依赖氨基变位酶(MIO-dependent aminomutase),可催化α-苯丙氨酸转化为β-苯丙氨酸,是目前最有效的抗癌药物—紫杉醇的重要前体物质。随着癌症在全球范围内发病率的逐年提升,β-苯丙氨酸需求量也日益增加。目前,在生产中大量获取β-苯丙氨酸的方法主要是化学拆分法和Mannich反应法等,这些方法步骤复杂,产物难以纯化,生产成本昂贵还会产生有毒有害的副产物。与这些方法相比,酶催化法有着高效、快捷、安全的巨大优势。β-苯丙氨酸变位酶作为可以高效催化生成β-苯丙氨酸的生物催化剂受到了越来越多的关注。本研究根据β-苯丙氨酸变位酶PAM基因序列设计合成上下游引物,利用PCR技术扩增了目的基因,并将其和表达载体pET-28a连接,构成了表达质粒pET-28a-pam。将表达质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21中,筛选阳性菌株,并通过酶切检测在菌株内是否成功转入目的基因条带,得到一株基因重组菌。通过对IPTG诱导剂的单因素试验确定了最佳诱导剂含量以及最佳诱导时间,并对重组菌进行诱导表达。以SDS-PAGE手段检测了重组菌的诱导表达并对重组酶进行了纯化。对重组酶的基本酶学性质pH、温度以及热稳定性进行了研究,确定了重组酶的最佳催化pH为9.0,最佳催化温度为50℃,并对重组酶的热稳定性进行了验证,发现其热稳定性较好。利用单因素试验和响应面法对重组菌的产酶条件进行了优化,确定了最优发酵条件为种龄:12.8 h,初始pH:6.7,发酵时间:25.2 h。在最优发酵条件下,重组菌产PAM最大酶活可达11.15 U/mL,较优化前提高了 128.9%。在3 L发酵罐中对重组菌进行扩大培养。利用单因素试验确定了最佳溶氧为30%。分别比较了未添加任何补料的发酵方式,培养20 h时流加30 mL补料培养基的发酵方式以及培养30 h时流加40 mL补料培养基的发酵方式。确定了补料发酵方式优于未进行补料的发酵方式,并且对比得到在20 h时进行流加补料的发酵方式优于在30 h时进行补料发酵的方式。以此方式进行扩大培养发酵所得最高酶活为16.63 U/mL,与摇瓶发酵相比提高了 49.1%,较优化前的菌株产酶活性共提高了 241.5%。


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