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砀山酥梨果实木质素合成关键酶基因CAD和SAD克隆及表达分析

尹梅  
【摘要】:砀山酥梨原产于安徽省砀山,由于自然环境恶劣、品种退化、田间管理粗放等原因导致其果实石细胞含量增多,果实肉质变粗,口感多渣,严重影响了砀山酥梨的食用品质和经济价值。木质素单体的合成及聚合在细胞壁沉积导致部分薄壁细胞木质化,引起细胞次生壁加厚形成石细胞。石细胞的发育与木质素的合成、转运及沉积密切相关。肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成过程中的一种关键酶,降低CAD活性有可能减少木质素单体的合成,芥子醇脱氢酶(SAD)在木质素合成中特异地将芥子醛还原为芥子醇。本研究以砀山酥梨果实为材料,克隆砀山酥梨果实木质素合成关键酶基因CAD和SAD,进行生物信息学分析。构建原核表达载体进行SDS-PAGE分析。分析PbCAD基因荧光定量表达分析。构建真核表达载体进行亚细胞定位分析。主要实验结果如下:1、利用RT-PCR技术和RACE技术,获得了PbCAD基因和PbSAD基因的全长并分别命名为PbCAD和PbSAD,基因登录号分别为KF268003和KF537783。PbCAD基因全长为1283bp,ORF阅读框978bp,编码325个氨基酸;PbSAD基因全长为1399bp,ORF阅读框1089bp,编码362个氨基酸。2、生物信息学分析表明:PbCAD的等电点约为6.61,呈弱酸性,分子量约为35.6kDa,无明显的跨膜结构和信号肽,存在特有的NADPH结合位点,具有表异构酶结构域,属于依赖于NADPH的表异构酶/脱水酶家族的氧化还原酶。PbSAD等电点约为6.86,呈弱酸性,分子量约为38.9kDa,PbSAD包含ADH_N结构域(醇脱氢酶GroES-like区域,主要是醇脱氢酶的催化部位)和ADH_zinc_N结构域(Zn结合区域),该蛋白结构域证明PbSAD属于醇脱氢酶蛋白。3、原核表达结果显示:成功构建了原核表达载体,PbCAD基因和PbSAD基因SDS-PAGE电泳显示各检测到与预期分子量大小相符的重组蛋白条带,说明PbCAD基因和PbSAD基因在大肠杆菌中均得到有效表达。4、荧光定量PCR结果表明:随着砀山酥梨果实的发育,PbCAD基因的表达量先上升后下降,花后63d达到最大值;PbCAD基因在不同部位表达量为近果皮果中部近果心。这与前人研究的石细胞和木质素变化趋势相一致,说明PbCAD基因参与了木质素的合成。5、将PbCAD基因连接到表达载体pCAMBIA1301-EGFP中,成功构建真核表达载体pCAMBIA1301-PbCAD进行亚细胞定位分析。


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