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茶树被茶尺蠖取食后引起差异表达的miRNA研究

张骁  
【摘要】:茶是世界上最重要的经济作物之一,同时也是最受欢迎的无醇饮料之一。茶尺蠖作为茶树的主要害虫,每年给茶树的生长发育带来严重的灾害。MicroRNAs(miRNAs)是一类内源的、长约17-25个核苷酸的非编码RNA,在生物与非生物逆境下起到重要的调控作用。探究茶尺蠖取食引起的miRNA的表达方式有助于了解miRNA在响应害虫取食后的基因调控模式。本研究利用高通量测序与微列阵芯片技术,对茶树被茶尺蠖取食和机械损伤前后差异表达的mi RNA进行了分离和鉴定,拟获得其被茶尺蠖取食及其口腔分泌液引起的差异表达的mi RNA。最后,利用降解组测序技术对这些差异表达的mi RNA进行了靶基因分析,并用RLM-5’RACE方法进一步验证了降解组测序的准确性。获得的主要结果如下:(1)分别对被茶尺蠖取食、机械损伤和未处理的茶树叶片样品(分别记作STL、SML和SCKL)构建small RNA(smRNA)文库,并进行高通量测序,去除其中的低质量序列、接头序列和冗余序列后,分别得到测序总量为2363062、2207927和3775038个reads,并用于各组中的miRNA鉴定。(2)通过分析发现,在STL、SML和SCKL样品中分别获得101、106和112条保守的mi RNA,以及462、406与478条茶树特异的miRNA;与对照试验组相比较,茶树被茶尺蠖取食后表达量存在差异的mi RNA有56条,其中上调表达的有32条,下调表达的有24条,茶树被机械损伤处理后,表达量存在差异的miRNA有50条,其中上调表达有28条,下调表达的有22条;而进一步通过miRNA芯片检测,发现茶尺蠖取食茶树后,发生差异表达的mi RNA共有37条,其中上调表达的有13条,下调表达的有24条,由机械损伤引起表达差异的miRNA有38条,其中上调表达的有10条,下调表达的有28条。(3)通过高通量测序方法鉴定出的茶树经茶尺蠖取食后发生差异表达的miRNA中,4条上调的miRNA与5条下调的miRNA中与芯片检测的结果一致,这9条miRNA很可能是响应茶尺蠖取食后的差异表达的miRNA。由高通量测序鉴定出的茶树经机械损伤处理后差异表达的miRNA中,4条上调的miRNA与5条下调的miRNA与微列阵芯片检测的结果一致,这9 miRNA很可能是响应机械损伤的差异表达的mi RNA。在响应茶尺蠖取食后差异表达的mi RNA中,扣除与响应机械损伤的相同的差异表达的5条miRNA后,余下的4条mi RNA则可能是茶尺蠖取食茶树叶片时,其口腔分泌液所引起的差异表达的mi RNA。(4)基于课题组前期获得的降解组测序结果,对上述高通量测序与芯片共同验证的响应茶尺蠖取食的差异表达的miRNA进行进行靶基因预测,发现有6条mi RNA有靶基因,这些基因涉及调控转录因子TCP、生长响应因子与Ca2+运输ATPase等功能;利用RLM-5′RACE技术,成功验证了其中的3个差异表达miRNA对各自的靶基因具有调控作用。


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