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乳酸乳球菌NFL菌株产类细菌素发酵条件的优化

洪婷  
【摘要】:与其他常见的微生物防腐剂相比,类细菌素的抑菌谱较宽、稳定性较好,因而具有更广的应用前景。本课题组前期分离筛选得到一株产类细菌素乳酸乳球菌NFL菌株,对常见的革兰氏阳性和阴性菌均有明显的抑菌活性,且热稳定性极强、对蛋白酶敏感,具有开发为食品防腐剂的潜力。目前对类细菌素效价测定方法应用最广泛的是琼脂扩散法,为了能准确地测定乳酸乳球菌NFL菌株的效价,对双层琼脂平板扩散实验效果的影响因素进行优化;为了使乳酸乳球菌NFL菌株稳定、高产类细菌素,对其种子培养基和全合成发酵培养基进行优化;为了得到最佳全合成发酵培养基的培养条件,对其培养条件进行优化。主要研究结果如下:双层琼脂平板扩散法测定乳酸乳球菌NFL菌株类细菌素效价的最适条件为:以大肠埃希氏菌为指示菌,以0.1%的接种量接入琼脂添加量为0.75%营养琼脂培养基中,平板放在30℃恒温培养箱中培养12h时。乳酸乳球菌NFL菌株种子培养基和全合成发酵培养基的优化:所试的碳源(果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖)中,以葡萄糖为碳源时生物量最高,比果糖为碳源的高3.1%,以果糖为碳源时类细菌素产量最高,但只比葡萄糖为碳源的高1.6%,从成本上考虑,选择葡萄糖为种子和发酵培养基的最佳碳源;所试的有机氮源(蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素)和无机氮源((NH_4)_2SO_4、NH_4NO_3、KNO_3)中,以蛋白胨为氮源时生物量最高,NH_4NO_3为碳源时生物量较低,但类细菌素单位细胞产量却明显高于有机氮源,因此选择蛋白胨作为种子培养基最适氮源,选择NH_4NO_3作为全合成发酵培养基最适氮源;采用单因素实验对20种基本氨基酸进行优化,结果显示其对生物量和产量均不具有显著性效应,因此选择不添加氨基酸;对MRS培养基原来的缓冲盐体系进行正交优化,结果表明最适生长的缓冲盐配方为磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵3g/L、乙酸钠3g/L,最适生产的缓冲盐配方为磷酸氢二钾1g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠7g/L;对培养基起始pH值在5.2-7.7范围内进行优化,结果表明随着pH的升高,生物量随之显著增大,到7.2时达到最高值后稳定,产量在pH为5.7时达到峰值,因此种子培养基选择pH为7.2,发酵培养基选择pH为5.7;所试的无机盐(MgSO_4、MnSO_4、K_2SO_4、ZnSO_4、CuSO_4、(Fe)_2(SO_4)_3、FeSO_4、FeCl_2、CaCl_2)中,单独添加MnSO_4时生物量和产量最高,且略高于对照(MgSO4和MnSO_4的组合),所以选择只添加MnSO_4作为种子及发酵培养基的无机盐;所试的乳化剂(Tween-20、Tween-40、Tween-80、Triton-100)均不能明显地提高生物量,但Tween-80可提高产量5.5%,所以选择Tween-80作为最佳发酵培养基的乳化剂;添加所试的刺激因子(NaCl、乙醇)会降低生物量和产量,所以选择不添加;所试常见B族维生素(VitB1、VitB2、VitB3、VitB5、VitB6、VitB7、VitB11、VitB12、Vit C)中,6种维生素可显著提高生物量,5种维生素(VitB3、VitB5、VitB6、VitB7、VitB11)可显著提高产量,采用正交实验设计进一步优化组合,得到种子培养基的维生素组成为VitB3 20mg/L、VitB7 5mg/L、VitB11 20mg/L、VitB12 5mg/L、Vit C 20mg/L,发酵培养基的维生素组成为VitB3 20mg/L、VitB5 20mg/L、VitB7 20mg/L;所试的碱基(胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤)中,尿嘧啶可使生物量提高46.6%,但四种碱基对产量的影响不大,因此选择在种子培养基中添加尿嘧啶,而发酵培养基选择不添加碱基。综合比较结果显示,与优化前的MRS培养基相比,最佳种子培养基可使乳酸乳球菌NFL菌株生物量提高13.8%;最佳全合成发酵培养基可使类细菌素产量提高22.2%。通过单因素实验对乳酸乳球菌NFL菌株产类细菌素的培养条件进行优化,结果显示,将对数末期即培养8 h的乳酸乳球菌NFL菌株发酵液以5%的接种量接种到发酵培养基中,在30℃下静置培养12h。


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