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ALV-J体内感染诱导NLRP3炎症体和MDA5介导的天然免疫反应

贾丽娟  
【摘要】:J亚群禽白血病病毒(Avian leucosis virus subgroup J,ALV-J)属于反转录病毒,可以引起鸡免疫抑制和多发性肿瘤。由于ALV-J变异速度快,机体较难获得有效的免疫保护,目前尚无防治该病的有效疫苗。天然免疫是机体抗感染的首要防线,病毒入侵后会被天然免疫系统识别,进而引发相关免疫通路的活化和抗病毒反应。天然免疫识别受体中Nod样受体(Nod-like receptors,NLRs)、RIG-I样受体(RIG-I-Iike receptors,RLRs)在抗RNA病毒中发挥着重要作用。本研究对ALV-J感染早期时黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)及核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族成员NLRP3炎症转导通路及调控机制进行探讨,为揭示ALV-J致病机制和宿主抗病毒免疫机制提供参考。首先,将本实验室分离的ALV-J临床株(命名为AJV-HF211)进行DF-1细胞增殖和鉴定,再将70只1日龄SPF鸡随机分为两组,攻毒组42只,对照组28只,经颈部皮下接种ALV-HF211细胞毒,0.2mL/只,2 x 104TCID50/mL,对照组接种细胞培养液,0.2mL/只。在感染不同天数后(days post infection,dpi)剖检观察病变,取肝脏制备石蜡切片。结果表明,攻毒组鸡胸腺出血、萎缩,肝脏和脾脏有出血点,胆囊萎缩、胆汁量少且呈淡黄色。此外,AJV-HF211毒株感染组织中炎性细胞增殖明显。其次,通过RT-PCR方法检测鸡肝组织中病毒的核酸片段并设计扩增MDA5、 NLRP3及其下游caspase-1及细胞因子IL-1β、1L-18、IFN-β和IFN-γ基因片段的特异性引物,进一步建立SYBR Green I实时荧光相对定量RT-PCR检测方法(RT-qPCR),分别检测感染组和对照组鸡肝组织内的MDA5、NLRP3及其下游接头分子和细胞因子的转录水平。RT-PCR检测ALV-J结果表明,在感染9dpi,首次检测到ALV-J特异性基因片段,且9-17dpi期间均能检测到该片段的存在。FT-qPCR结果表明,与未攻毒的对照组相比,AJV-HF211毒株感染可诱导鸡体内MDA5. NLRP3及其下游caspase-1、IL-1β 和 IL-18基因的转录水平均有不同程度增加,而IFN-β和IFN-γ的表达无明显变化。其中,NLRP3/caspase-1在1-3 dpi表达变化不明显,而在5-7 dpi时明显升高(p0.01),在9dpi开始下降;IL-1β、IL-18 在 1-5dpi无明显变化,在7-17dpi表达量明显升高(p0.05)。这表明炎症初期NLRP3转录水平显著增加,且变化趋势和caspase-1、IL-1β和IL-18基因基本一致。MDA5在1-5dpi时变化不明显,但在7-17dpi保持较高转录水平趋势。上述结果提示,NLRP3/ caspase-1炎症通路和MDA5受体在AJV-HF211感染早期可能发挥重要作用,而AJV-HF211毒株可能通过负向调控干扰素诱生机制逃逸免疫应答。最后,将鸡饲养至240日龄,观察肿瘤发生情况,并取肝脏组织制作石蜡切片,HE染色观察细胞状态。结果表明,AJV-HF211毒株感染部分鸡精神萎靡,食欲不振,羽毛蓬乱,伴有腹泻消瘦,贫血等症状;剖检观察到肝脏、心脏、卵巢均有实质性增生物出现。石蜡切片HE染色结果表明,攻毒组肝脏有明显的肿瘤灶,表现为髓细胞瘤和血管瘤。此外,还可见淋巴样细胞浸润,肝细胞索消失,细胞核崩解等病理变化。上述结果表明,本实验室AJV-HF211分离毒株经人工感染可对部分感染鸡具有致瘤性,其致瘤作用可能与鸡本身抗性有关。综上所述,AJV-HF211毒株感染早期和后期均可导致病鸡发生明显病变,并具有致瘤性。在感染早期时可诱导MDA5 及 NLRP3/caspase-1炎症通路的明显上调,但IFN-β 和 IFN-γ诱生受阻,这可能与ALV-J免疫逃逸有关。


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