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鸭疫里默氏杆菌培养上清中分泌蛋白的初步研究

孙冰清  
【摘要】:鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是里默氏杆菌属的代表种,主要感染鸭和鹅,火鸡和其他禽类及野鸟类也能感染。感染鸭呈急性败血症或慢性过程,以纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征,因病鸭死亡率高、消瘦、生长发育迟缓、品质下降、疾病治疗等给世界范围的养鸭业造成重大的经济损失。鸭疫里默氏杆菌已报道的的血清型至少有21个,但各血清型之间缺乏有效的交叉保护,这给鸭疫里默氏杆菌病疫苗的研制带来困难。另外,目前对于鸭疫里默氏杆菌的致病机制及保护性抗原等还知之甚少。分泌蛋白在细菌间的信号传递、致病性以及免疫等方面起着重要的作用。本试验首先提取了鸭疫里默氏杆菌培养上清中的分泌蛋白,通过免疫蛋白质组学的方法对提取的分泌蛋白中有免疫原性的蛋白进行鉴定和分析,并比较了不同菌株间分泌蛋白点的差异,为分析鸭疫里默氏杆菌的毒力相关基因和保护性抗原等提供一些信息。1.鸭疫里默氏杆菌分泌蛋白的提取采用三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA)-乙醇沉淀法提取了鸭疫里默氏杆菌强毒株HXb2(血清10型)、YXb1(血清10型)、弱毒株NJ-1(血清1型)菌株在37℃TSB培养基中的分泌蛋白。经Bradford法定量,HXb2、YXb1、NJ-1株培养上清中分泌蛋白的浓度分别为12.34、11.16和4.52μg·μL~(-1)。2.双向凝胶电泳(2-D)鉴定分泌蛋白样品中蛋白点对提取的三株鸭疫里默氏杆菌的分泌蛋白分别进行双向凝胶电泳分离,经免疫印迹技术和基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱MALDI-TOF-MS鉴定到具有免疫原性的蛋白点。共测定了42个蛋白点,鉴定到了24种蛋白质。经GO(gene onthlog)蛋白质功能分类数据库预测分析,这24种蛋白中有18种蛋白可以预测其亚细胞定位。除了翻译延伸因子、滑动运动蛋白和分子伴侣定位在细胞质外,其余蛋白均为膜蛋白,推测是外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)的成份。另外,这24种蛋白可能参与22种生物过程(biological process)和15种分子功能(molecular function)等有关。KEGG pathway蛋白质代谢数据库预测18种能分析亚细胞定位的蛋白主要与碳水化合物代谢及其他氨基酸代谢有关。检测的42个蛋白点(24种蛋白)中有36个具有免疫原性,除了三种假定蛋白(gi|516282769、gi|441482924、gi|874269116)及外膜蛋白OmpH外,其他20种蛋白均能够与鸭抗HXb2株阳性血清反应,表明这20种分泌蛋白具有免疫原性;而同为血清10型的YXb1株共10种分泌蛋白具有免疫原性蛋白,且10种免疫原性蛋白在2株血清10型鸭疫里默氏杆菌的分泌蛋白中均存在;弱毒株NJ-1株培养上清中蛋白点明显少且只鉴定到3种分泌蛋白具有免疫原性蛋白。这些蛋白中是否有与鸭疫里默氏杆菌致病性相关及免疫保护性相关的蛋白等还需要进一步研究与验证。


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