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大豆疫霉有丝分裂S期激酶蛋白相关基因PsSkp1克隆与功能分析

刘栓林  
【摘要】:大豆疫霉根腐病是一种毁灭性的土传病害,由Phytophthora sojae引起。该菌寄主范围窄,只侵染大豆。细胞有丝分裂S期激酶相关蛋白Skp1是泛素连接酶家族SCF复合物(Skp1-Cul1-F-box蛋白)的一个成员,大豆疫霉主要是通过菌丝体和游动孢子进行病害的传播,如果能够破坏菌丝体的生长和游动孢子的产生,就可以有效的防治病害。本文研究的细胞有丝分裂S期激酶相关蛋白Skp1白能够影响生物体内蛋白质的分泌,调节细胞的生理周期,并参与生物发育过程。本验通过RAN干扰技术,构建了Phytophthora sojae Skp1基因的沉默表达载体pTOR-Skp1-GFP。利用原生质体介导转化方法,将沉默载体导入野生型大豆疫霉6497中,从而使目的基因得到瞬时表达,实验获得了该基因的沉默突变菌株。通过qRT-PCR实验,选择出突变菌株中Skp1基因表达量比较低的两个菌株,命名为L1、L2进行实验。通过胁迫、菌丝侵染、游动孢子诱导和致病性测定、电镜观察试验,对沉默突变体进行表型分析。通过对沉默突变菌株进行生长速率测定试验,发现沉默突变体的生长速度较为缓慢;把突变体在胁迫培养基上培养,分析得出其抗氧化能力和耐盐性均有所减弱;诱导菌株游动孢子囊及游动孢子,发现产生沉默突变体游动孢子囊数量减少,为原始菌株的20%-30%;通过对致病性研究发现沉默突变体的菌丝生长畸形,分枝较多,顶端较粗,提前衰老死亡,对寄主大豆侵染能力和致病性均下降;游动孢子对大豆黄花苗侵染能力和致病性均下降。


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