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一种白僵菌代谢产物中自由基清除剂发酵条件和提取工艺的研究

付瑞燕  
【摘要】: 本文对一株白僵菌(Beauveria sp.)Ba02菌株自由基清除剂发酵和提取工艺进行了研究,主要内容包括:营养性因子和非营养性因子对自由基清除剂合成的影响;16 L机械搅拌发酵罐和7 L气升式发酵罐的深层发酵条件的初探;自由基清除剂提取工艺的改进。 不同碳源因子试验显示:在供试的10种碳源中,白砂糖、蔗糖和甘油有利于自由基清除剂的形成,其中碳源以白砂糖最好。混合碳源试验结果表明,蔗糖与甘油搭配,有利于自由基清除剂产量的提高。通过不同氮源试验发现,在供试的8种氮源中,黄豆粉和酵母粉是较适宜的氮源,但从原料的来源、价格等经济因素来考虑,以黄豆粉最佳。在起始pH为8的条件下,在无机盐正交试验中针对7种无机盐和生长促进因子分别设置了3个水平,试验结果表明K_2HPO_4、MnSO_4·H_2O、麦芽汁对自由基清除剂的合成在99%置信度上有显著性影响。在培养基浓度配比试验中,针对已筛选出的碳、氮源和无机盐进行了正交试验,确定了Ba02菌株产生自由基清除剂的最佳培养基配比:蔗糖30g/L,甘油6ml/L,黄豆粉10g/L、K_2HPO_41g/L、MnSO_4·H_2O 0.006g/L、麦芽汁20ml/L。 非营养性因子中研究了pH、温度、种龄、接种量、装液量和搅拌速度等因子对自由基清除剂生成和生物量的影响,其中pH对自由基清除剂生成和生物量影响的试验结果表明:起始pH为8,在培养过程中,当pH值降至4.5时,用已灭菌的HC1(1M)或NaOH(1M)培养液(其营养浓度同培养所用的培养基浓度)调节pH至7.5,有利于自由基清除剂产量的提高。在温度对生物量和自由基清除率的影响试验中,设置了3个供试温度:20℃、25℃、30℃,结果表明25℃下有利于生物量和自由基清除剂的生成。针对种龄、接种量、装液量和搅拌速度四个因素,设置了3个水平,正交试验结果表明在250ml三角瓶中接种种龄7d的Ba02种子,以5%接种量接入发酵培养基中,在25℃条件下,以180rpm转速培养最有利于自由基清除剂产量的提高。 比较了优化培养基与培养条件对Ba02菌株自由基清除率的影响,结果表明: 从自由基清除剂生成的角度考虑,在相同的优化培养条件下,优化培养基使得自由 基清除率提高了 24.14%;在待优化培养基与待优化培养条件下,Bacl菌株比 Ba02 菌株自由基清除率提高了 7.4%,表明 Baol菌株比 Ba02菌株更适宜于无氧发酵。 总的看来,Ba02菌株在优化培养基与优化培养条件下于发酵第 6 d达到自由基清除 剂产量最高峰58.55%,而Baol菌株在待优化培养基与待优化培养条件下于发酵 第 17 d达到自由基清除剂产量最高峰 32刀5%;经过菌株筛选、营养性因子和非营 养性因子的一系列优化,结果自由基清除剂产量最高峰值增加了 26.5%,发酵周期 缩短了* d,故优化效果十分明显。 在液体振荡培养试验的基础上,进行了16 L机械搅拌发酵罐和7 L气升式发 酵罐的深层发酵条件的初探。结果表明Ba02菌株菌丝生长和自由清除剂的生成对 氧气的需要量很大,对于机械搅拌罐来说,在通气量大于 1:0.9(V/V/In),同时转 速大于450 rpm时,对菌丝生长和自由清除剂的生成有利。 为了寻找一种低能耗、低污染的提取工艺,以自由基清除率为指标,对温度、 浓缩比例、抽提用溶剂、不同抽提方式和抽提时间和不同抽提比例进行了优化,结 果表明最佳提取工艺为:将发酵液经孔径为0.8 pn的超滤膜处理后,在90 OC下 浓缩至最小体积,浓缩液在静置条件下用乙酸乙酯以1:川的比例革取lh,将荤 取液脱溶,冷冻干燥后得粗提物。 将Ba02菌株发酵液乙酸乙酯粗提物与市售四种保健品的自由基清除作用做了 比较,结果表明其有较强的清除DPPH作用,从生产周期和生产成本上来看,有较 强的竟争力。 同时,对该菌株产生的的单胺氧化酶抑制剂的抑制率作了初步测定,结果表明 Ba02菌株发酵液中有一定的单胺氧化酶抑制剂,其发酵生成曲线与自由基清除剂 的不一致。根据体内(抗抑郁经典模型)试验结果,Ba02菌株发酵液中的单胺氧 化酶抑制剂可能具有抑制单胺氧化酶A型的活性。


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