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桑蚕对马尾松毛虫质型多角体病毒敏感性及病毒基因组中若干片段研究

洪靖君  
【摘要】: 本论文包括两章内容。第一章为桑蚕对马尾松毛虫质型多角体病毒的敏感性研究。用虫体克隆技术,对马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株进行了分离纯化,鉴定其为1型质多角体病毒。以家蚕春蕾×镇珠杂种F_1、F_2代二龄起蚕进行毒力试验,同时用家蚕1型质多角体病毒为对照。结果表明:马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株能引起蚕儿发病,但毒力小于家蚕质型多角体病毒且差异显著;马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株感染家蚕试验种F_1和F_2代幼虫28天后的半致死剂量(LD_(50))分别为885和18 CPB(质多角体),前者为后者的49倍,说明F_2代家蚕幼虫较F_1代对该病毒更为敏感。马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株感染后的家蚕,其结茧率、化蛹率、羽化率、全茧量、茧层量和单蛾产卵数均有所下降;F_2代、F_1代羽化率与病毒感染剂量成负相关,且分别达显著和极显著水平;全茧量、茧层量、茧层率、单蛾产卵数与病毒感染剂量无显著关联。 第二章研究内容为马尾松毛虫质型多角体病毒基因组中S6,S7和S10cDNA克隆、序列分析及S7cDNA部分序列的原核表达。基因组中dsRNA片段经RT-PCR反应得到目的cDNA,与克隆载体连接后,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,阳性克隆经酶切、电泳鉴定后测序。研究结果表明:基因组第10片段(S10)cDNA含有944个核苷酸,编码分子量为28.5kD,由248个氨基酸组成的多角体蛋白;在正链的第1-5核苷酸与第680-684核苷酸处含有反向重复序列,即5’-AGTAA-3’和5’-TTACT-3’,提示其5’末端序列与内部序列可以形成较为复杂的二级结构。DpCPV-HN S10与BmCPV-1 S10相比较,核苷酸序列同源性为91.2%,多角体蛋白氨基酸序列同源性为98.0%。DpCPV两个毒株(江西株与湖南株)多角体蛋白基因的开放阅读框序列共有6个核苷酸位点发生替换,仅导致多角体蛋白氨基酸序列1个位点发生替换 即江西株LyS209一湖南株挪209,它们分别由 AAA和 AGA编码。S7 CDNA 含有1501个核昔酸,编码分子量为49.8 l,由448个氨基酸组成的多肽p50, 氨基酸序列中含一个核定位信号,与 Mycophalna hominis的 DnaK样蛋白具 有序列相似性。DpCPV-HN S7与BmCPV4 的核着酸序列同源性为 87刀%, 编码的氨基酸序列同源性为 92.8%。S6 OM由 1686个核苦酸组成,编码分 子量为 63.7 o,含有 561个氨基酸的多肽 p64,氨基酸组成中有较高的亮氨酸 含量10 0%),氨基酸序列中各含一个亮氨酸拉链结构和 ATP/GTP结合位点,具 有两个核定位信号,预示其可能具有与核酸结合的活性,在病毒复制中起重 要作用小64与 RRSV Pns7蛋白具有序列相似性。DpCPV-HN S6与 BmCPV刁 S6相比,核着酸序列同源性为837%,编码的氨基酸序列同源性为92.5%。 对编码p50C259的CDNA序列进行克隆,构建成融合基因表达载体 pET上 人),转化至BLZI中,用IPTG进行诱导表达,得到分子 量约为 37.3 kDa的融合蛋白,它比根据氨基酸序列预测的 329 kDa要大。对 表达条件进行了优化,当用 10mmoffe IPTG诱导Zh,表达量取得较好的效 果。


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