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茶树β-葡萄糖苷酶基因克隆、表达和分布定位

李远华  
【摘要】:茶树体内的各种物质代谢、能量传递、信息转录以及生长发育等都必须有酶的参与,酶对茶叶品质形成具有重要意义,酶学研究是茶叶的重要理论。而β—葡萄糖苷酶与茶叶香气有关,香气是衡量茶叶品质好坏的重要指标之一。 β—葡萄糖苷酶属于水解酶类,存在于自然界许多植物体,还存在于一些酵母、曲霉菌、木霉菌属及细菌体内。它的特性是可水解结合于未端、非还原性的β-D-糖苷键,同时释放β-D-葡萄糖和相应的配基;此外还能微弱地水解对硝基苯-β-D-半乳糖和β-D-木糖苷。在纤维素的糖化作用中,β-葡萄糖苷酶功能是将纤维素二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖。根霉能在许多种纤维素物质上生长,正是由于它能产生包括β-葡萄糖苷酶在内的多种纤维素酶所致。 在茶叶上研究主要是该酶与萜烯类香气前驱体有密切关系,使糖苷键合态变成游离态。对茶叶中β-葡萄糖苷酶的研究,最早是1981年Takeo T利用茶叶匀浆试验,发现茶叶匀浆添加β-葡萄糖苷酶后,亦能产生芳樟醇和香叶醇,证实茶叶中存在以葡萄糖苷形式存在的单萜烯醇。目前对茶树β-葡萄糖苷酶的研究已深入到其与茶树品种、生态因子、加工工艺上。从分子生物学水平,研究β-葡萄糖苷酶基因克隆和表达,在燕麦、蜀黍、旱金莲、长春花、黄檀等许多植物中都有报道,但在茶树上至今国内外未见报道。 本实验针对β-葡萄糖苷酶研究现状,主要从以下几方面来研究:茶树β-葡萄糖苷酶cDNA的克隆及在原核中表达,茶树中β-葡萄糖苷酶基因mRNA表达和分布定位情况。 茶树β-葡萄糖苷酶cDNA的克隆,主要采用江昌俊等人方法提取茶树RNA和Gibco公司3′/5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒进行,研究结果表明,茶树β-葡萄糖苷酶cDNA全长序列1475bp,该序列的ORF由1350个核苷酸组成,编码450个氨基酸,5′非翻译区(5′-UTR)与3′非翻译区(3′-UTR)分别为33个和92个核苷酸组成。信号肽由28个氨基酸组成。预测序列氨基酸功能结构域有:4个N-豆蔻酰化位点(NSTK~(202)、NFTK~(206)、NRTQ~(238)、NRSS~(307),5个蛋白激酶C的磷酸化位点(SNR~(185)、STK~(202)、TSK~(247)、TLR~(270)、STR~(371)),2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(SIVF~(112)、TLNE~(350)),5个N-糖基化位点(GGHASK~(67)、GQASGS~(281)、GIRCCR~(288)、GGLCAA~(317)、GQKGSG~(331))。其核苷酸序列同 安徽农业大学博士学位论文:中文摘要 源性分析,与一些木本植物有比较高的相似性。与草本植物相对更低。从推导出的氨基 酸序列保守性来看,第88、420、614有氨基酸残基的G,第204个氨基酸残基Y,第345 个氨基酸残基I,其氨基酸序列完全保守,另有10%左右序列与部分植物比较一致。从 系统进化树来看,茶树与黄檀植物亲缘关系最近,与鼠耳芥中的一个种类(AY045953) 和小干松也比较相近,与大麦植物关系较远,而与玉米中的一个品种(U25157)关系最 远,反映了茶树与这些植物物种间差异较大。预测茶树母一葡萄糖昔酶二级结构可以形 成14.33%的a一螺旋、25.43%的日一折叠。 茶树p一葡萄糖昔酶在原核中表达,主要采用Novagen公司菌株点co1z’ BL21trxB (DE3)和表达载体pET一32a进行p一葡萄糖昔酶表达,酶活性测定参考张正竹的方法。 研究结果显示,实际诱导表达的茶树p一葡萄糖昔酶成熟蛋白分子量为37KDa, pET一32a/Mp一Glc融合蛋白在工PTG诱导3h的表达量最高,表达量占菌体总蛋白的32.2%, 表达的蛋白经测定具有正常的生物学活性。在诱导0h时没有表达蛋白,诱导o.sh时表 达的蛋白量很少,诱导lh、2h时表达量逐渐增加,诱导4h、7h时表达量也基本稳定在 3h的水平,表达量没有明显增多。不同培养温度对表达蛋白也有影响,在Ilnmol.L一‘工PTG 诱导3h,45℃与37℃表达量差不多,26℃比37℃表达量要少,26℃表达蛋白量在工PTG 诱导3h时仅37℃的1/10。采用0.1、0.5、Ilnmol.L一‘工PTG三种浓度诱导表达,37℃ 同样诱导3h,表达蛋白量差异不大。不同部位的表达蛋白存在形式来看,培养基组分中 没有发现目的蛋白,周质中也没有发现有表达蛋白,而原核细胞中可溶性细胞质蛋白和 不可溶的细胞质蛋白却有较多的表达,其中可溶性细胞质蛋白比不溶性多些,可溶性细 胞质蛋白占表达总蛋白的3/5,不可溶的细胞质蛋白占表达总蛋白的2/5。 茶树p一葡萄糖营酶mRNA变化研究,采用Roche公司地高辛RNA标一记试剂盒,原位 杂交过程参考武汉博士德公司的方法。表达结果茶树叶片的p一葡萄糖昔酶mRNA表达主 要部位在栅栏组织,上表皮、下表皮、海绵组织等其它的组织则只有较弱的表达信号; 叶片栅栏组织mRNA表达分布,在细胞核表达信号强,清晰、色明,细胞质部分有表达信 号,其中包括液泡等部分细胞质没有表达信号;叶片的海绵组织内,细胞核有表达信号, 但比栅栏组织弱,少部分的细胞质有表达信号;叶片上表皮细胞核有弱表达信号,细胞 质只有少部分有表达信号;叶片下表皮细胞核有弱表达信号,细胞质部分有表达信号。 茶树叶主脉的p一葡萄糖营酶基因mR琳表达部位在薄壁组织,韧皮部也很难观察到表达 安徽农业大学博士学位论文:中文摘要 信号,而上、下表皮和?


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