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茶树中咖啡碱合成酶基因的抑制及在其它生物体中的表达

余有本  
【摘要】:咖啡碱(1,3,7-三甲基黄嘌呤)是茶叶中嘌呤碱的主体成份,约占干物质量的25%。它是世界上应用最广泛的药剂之一,适度摄入咖啡碱可以兴奋神经中枢,有利于提高反应速度、集中注意力和消除疲劳。然而,摄入过量的咖啡碱会对人体产生短期的负面作用,如会引起心悸、胃肠痛、焦虑、烦躁、失眠、呼吸频率增加、血压升高、心率失常,并可能诱导心肌梗塞和冠心病的的发生;另外,摄入过量咖啡碱还可增加患某些癌症(如尿道癌、膀胱癌、乳腺癌等)的机率。正是由于以上这些不利的负面作用,所以在国内及国际市场上,都希望有脱(低)咖啡碱的茶叶和茶饮料的产品。本研究以龙井43#为材料,比较系统地研究了茶树的再生体系,克隆并在大肠杆菌中和烟草中表达了茶树咖啡碱合成酶(tea caffeine synthase, TCS)基因。另外,还利用反义RNA技术和双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)技术抑制咖啡碱合成酶基因的表达。 目前去除咖啡碱的方法主要是通过常规育种的方法选育低咖啡碱茶树品种,或在茶叶加工过程中运用超临界萃取法。但是,通过常规育种的方法选育低咖啡碱茶树品种,至少需要20年左右,而且选育出的茶树品种不一定能适制多种多样的茶叶和茶饮料;加工过程中用超临界萃取法去除咖啡碱会严重影响到茶叶品质,尤其是茶叶香气和滋味。以上这些方法都不能从根本上解决脱咖啡碱问题,因此,为了满足市场上对脱咖啡碱茶叶的需求,应用基因工程的方法培育低咖啡碱茶树可能是一确实可行的途径。反义RNA技术是一种很有效的使基因沉默的方法,目前已广泛应用于植物的遗传育种中。本实验通过RT-PCR扩增了800 bp的TCS基因cDNA片段,该片段包括5’端非编码区和部分编码区序列;然后将该片段反向插入到双元载体pBI121的35S启动子下游,构建成表达TCS反义RNA的中间表达载体;再通过农杆菌叶盘转化法转化由茶树子叶诱导产生的愈伤组织,结果获得了抗性愈伤组织;PCR和RT-PCR验证结果表明,TCS反义基因已整合到抗性愈伤组织的基因组中,并能表达反义RNA。在茶树遗传育种领域,应用反义RNA技术尚属首次,本实验获得的抗性愈伤组织有望成为低咖啡碱的茶树小植株。 DsRNA技术是近几年才刚刚发展起来的新技术,将上述DNA片段正向和反向插入到双元载体pBI121的35S启动子下游,两片段之间由约400 bp的GUS基因片段隔开,形成反向重复序列,由此构建成了表达TCS基因dsRNA的中间表达载体。通过了农杆菌叶盘转化法转化由茶树子叶诱导产生的愈伤组织,结果也获得了抗性愈 WP=4 伤组织。由于茶树抗性愈伤组织生长非常缓慢,还未进行鉴定工作。 本研究在前人的基础上,对各种因素对愈伤组织诱导和体细胞胚的发生以及其分化率的影响作了比较系统的研究。用叶片、茎段和叶柄均可诱导产生愈伤组织,从诱导愈伤组织的效果来看,2,4-D优于NAA,而且高浓度的2,4-D容易诱导愈伤组织产生不定根。实验结果表明,来源于营养器官的外植体往往只能分化出根,较难分化出芽,来源于种子的子叶外植体较易诱导体细胞胚或不定芽。通过本研究,确定了“子叶外植体→体细胞胚(分化芽)→再生植株”的茶树再生体系,克服了制约茶树基因工程研究的瓶颈,为将来茶树的遗传转化奠定了基础。 咖啡碱合成酶是茶树中咖啡碱生物合成途径中的关键酶,催化最后两步甲基化反应。通过RT-PCR法扩增出TCS基因cDNA编码区全序列,并将其克隆到表达载体pET-32a(+)中,在表达宿主菌BL21trxB(DE3)中高效表达产生分子量约为62 kDa的融合蛋白,该融合蛋白包括112个氨基酸残基的硫氧还原蛋白及370个氨基酸残基的TCS蛋白。随着诱导时间的延长,表达的融合蛋白产量逐渐增加,表达蛋白总量最高可达到菌体总蛋白的39.14%;在15 °C、25 °C和37 °C三个不同的诱导温度下,均能诱导产生融合蛋白,而且产生的融合蛋白的总量及其可溶性部分所占比例均随诱导温度升高而增加;在菌体的各个部位中,融合蛋白主要在细胞质中以可溶的形式进行表达,有少量在外周质中表达或以包含体形式在细胞质中表达。另外,体外酶促反应表明表达的融合蛋白能催化可可碱甲基化生成咖啡碱,具有正常的生物学活性。 将TCS基因cDNA全序列克隆到双元载体pBI121中,首次通过农杆菌叶盘转化法将TCS基因成功转入烟草,结果得到72株转基因烟草苗。通过PCR检测和Southern Blotting检测,外源基因已整合到基因组中;RT-PCR和Northern Blotting结果表明外源基因能进行正常转录;用从转基因烟草植株中提取的粗酶液进行体外酶促反应,结果可以催化7-甲基黄嘌呤和可可碱向咖啡碱的转变,说明这些转基因植株中表达了茶树咖啡碱合成酶,且具有正常的生物学活性。


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