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绢丝昆虫野桑蚕与柳蚕卵黄原蛋白的研究

董胜张  
【摘要】:本论文包括两部分主要内容。第一部分是野桑蚕卵黄原蛋白的鉴定与cDNA序列的分析,以及卵黄组成的研究。利用SDS-PAGE和Western blotting的方法分析鉴定了野桑蚕卵黄原蛋白是由大小两个亚基组成,根据分子量marker得出分子量分别为175 kD和42 kD。对不同性别和不同时期野桑蚕血液的SDS-PAGE分析说明了,野桑蚕卵黄原蛋白存在性别、时期的特异性。通过对野桑蚕吐丝期开始至第5日的雌体脂肪体总RNA的含量进行了比较得出,从吐丝期开始到第5日逐渐递增,与野桑蚕的血液中卵黄原蛋白的含量的变化是一致的。利用昆虫卵黄原蛋白进化上的保守性,根据家蚕的Vg cDNA序列设计4对特异性引物在野桑蚕的总RNA进行RT-PCR扩增,分别得到了4条1000bp左右的cDNA片段:对于3’-end和5’-end进行RACE扩增,分别得到了2条1000bp左右的cDNA片段,根据cDNA片段的重复性,从而解析出野桑蚕卵黄原蛋白cDNA全序列。该序列含有5754碱基,由一个ORF组成,编码1780个氨基酸,卵黄原蛋白的氨基酸序列和cDNA序列与家蚕的同源性分别为97.6%和98.1%。含有特定的酶切识别结构RSRR,卵黄原蛋白前体被酶切为大小两个亚基,根据氨基酸推算的相对分子质量分别为161.571 kD和40.794 kD,如果考虑到翻译后的修饰,这与SDS-PAGE的结果是吻合的。该序列含有一个多聚丝氨酸区,出现在切割位点后的17氨基酸处,DGQR和GICG分别出现在第1581和1597氨基酸处,C末端含有6个保守的半胱氨酸。根据已经解析的18种昆虫卵黄原蛋白的氨基酸序列构建了系统树,结果证明了昆虫卵黄原蛋白的一级结构在进化上具有很好的保守性,尤其是5种绢丝昆虫卵黄原蛋白,它们的氨基酸序列同源性与RAPD分析的结果是一致的。通过家蚕与野桑蚕卵的内容物的SDS-PAGE,分析了野桑蚕卵黄蛋白主要有卵黄磷蛋白(Vtn),卵雌异性蛋白(ESP)和30K蛋白组成。通过Native-PAGE分析推定了野桑蚕卵黄原蛋白在天然状态下的分子量约为440kD。 第二部分是柳蚕生物学特性以及卵黄原蛋白的鉴定。柳蚕(Actias seleneHübner)是吐丝结茧的经济昆虫之一,属鳞翅目,大蚕蛾科,国内外对其相关的研究较少,作为一种野生绢丝昆虫,对其研究具有很重要的意义。本文通过室内 饲养的方法,观察了柳蚕的生物学特性,在合肥地区幼虫四眠五龄,二化胜,蛹 滞育,全龄期达40d以上。通过扫描电子显微镜观察了柳蚕卵孔的显微特征, 对其形态进行了描述,并与其它野蚕进行了比较。通过SDS一PAGE和Westem blotting鉴定了柳蚕的卵黄原蛋白是由大小两个亚基组成,分子量分别为1 75 kD 和45 kD,存在组织、时期、性别表达的差异性。


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