多形白僵菌（Beauveria amorpha）代谢物中单胺氧化酶抑制剂的研究

【摘要】：在一次对供试菌株抑制单胺氧化酶活性物质的筛选过程中，发现一株多形白僵菌菌株Ba02 [Beauveria amorpha (Hohn.) von Arx]发酵液 的代谢产物具有很强的抑制单胺氧化酶活性。本试验就是建立在此基础上展开了进一步的研究。主要内容包括：发酵液乙酸乙酯萃取脂溶相样品半数抑制浓度（IC50）及其动力学特征的研究；最佳发酵时间的确定；活性组分的分离提取工艺和纯化技术路线；甲醇提取物的体内活性研究；单一化合物的结构鉴定。 浓度和抑制单胺氧化酶（MAO）活性关系研究表明：在一定浓度范围内Ba02菌株发酵液脂溶相组分对MAO的抑制活性呈量效关系，经计算得出其对MAO-A、MAO-B抑制的IC50分别为18.3μg.ml-1、28.2μg.ml-1；抑制特征曲线表明Ba02菌株发酵液脂溶相组分对MAO-A呈竞争型抑制，对MAO-B为混合型抑制，Km值分别为0.47×10-5mol.L-1、 0.11×10-5mol.L-1。 应用薄层层析试验得出：Ba02菌株的最佳发酵时间为10.5d 。 通过对最佳浓缩温度、萃取试剂、萃取体积比、萃取次数的筛选试验，确定了最佳提取工艺：50℃浓缩发酵液至原体积的1/5，3倍体积95%乙醇（乙醇终浓度为70%）醇沉，弃沉淀并脱醇后，以乙酸乙酯为萃取试剂，2：1的体积比进行萃取，分三次萃取，取脂溶相，脱去乙酸乙酯有机溶剂后冷冻干燥。 本试验采用硅胶吸附层析色谱对粗提物进行初步纯化，通过薄层层析进行最佳流动相筛选，结果表明：Ba02菌株脂溶相组分在展开剂为乙酸乙酯：甲醇：水=85：10：5时，各斑点分离效果最佳。因此选用同样极性配比的溶液作为脂溶相组分的柱层析洗脱剂。 由于初步纯化已得到了较好的分离效果，本试验直接应用高效液相色谱进行进一步纯化，最终得到四个纯度较高的纯品。应用薄层层析法（TLC）、高效液相法（HPLC）进行纯度鉴定，结果表明：四个样品均为单一组分，并对含量最高（86%）的组分JL-1的结构进行了相关的研究。 质谱（MS）、核磁共振（NMR）、红外光谱（IR）以及紫外光谱（UV）分析表明：该组分的分子量为306，初步推断其分子式为C14H10O8。经Champman Hall 天然产物数据库查询，该化合物为一已知化合物。数据库中有关该化合物的理化性质描述与本研究分离得到的完全一致。因此可知本研究所得到的MAO抑制剂为节卵孢素（Oosporein），此种化合物对MAO的抑制活性尚属首次发现。 Ba02菌株甲醇提取物具有良好的抑制单胺氧化酶-A作用。且在对未预知的慢性小鼠抑郁模型脑组织线粒体单胺氧化酶活性的测定中发现，Ba02菌株甲醇提取物在25、50、100mg.kg-1三个剂量组对慢性应激模型小鼠脑组织线粒体MAO-A，B活性均有明显的抑制作用，并呈现一定的量效关系。