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拟态弧菌毒素共调菌毛的检测及其生物学特性研究

胡守奎  
【摘要】:拟态弧菌(Vibrio mimicus)是弧菌属常见的病原菌之一,广泛分布于自然水域和水产动物体内。当水质恶化或机体免疫力下降时拟态弧菌大量生长繁殖产生多种毒力因子,不仅能引起鱼类、甲壳类等水产动物严重的弧菌病[1~4 ],给水产养殖业造成巨大经济损失[5,6]。还可通过水产动物和水产品感染人类,引发季节流行性肠道传染病,危及人类健康。因此,对拟态弧菌的生物学特性、致病机理和疫苗研制等方面的研究具有重要意义。目前人们对霍乱弧菌(Vibrio Cholera)的致病机理研究得最为透彻,霍乱弧菌首先依靠其表面的毒素共调菌毛(Toxin Coregulated Pilus,TCP)在小肠粘膜表面粘附定居,然后大量生长繁殖,产生毒力因子作用于靶细胞而引起腹泻。TCP作为一种重要毒力因子,广泛存在于古典型、ELTOr型和O139型霍乱弧菌表面,通过介导细菌粘附组织细胞和协同毒素基因的表达参与致病过程。关于拟态弧菌是否表达TCP,TCP在拟态弧菌致病过程中的作用及其生物学特性等方面的研究,国内尚未见有报道,国外的研究也主要集中在对不同来源的拟态弧菌进行TCP检测[7]。本研究室从省内养蟹场发病河蟹体内分离鉴定到一株毒力较强的拟态弧菌(HX4菌株),并对其外毒素进行了研究。本课题拟在应用PCR技术和电镜技术证实拟态弧菌HX4菌株为TCP+株的基础上,进一步优化TCP最佳表达条件,建立TCP提取方法和系统研究TCP的生物学特性。旨在全面揭示拟态弧菌HX-4菌株的致病机理,同时也为研制TCP疫苗预防水产动物弧菌病奠定理论基础。 首先,应用PCR技术和电镜技术对拟态弧菌HX-4菌株进行TCP检测。根据基因文库中登录的霍乱弧菌tcpA基因全序列,设计一对特异性引物,对HX4菌株基因组DNA进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳检测其扩增片段的长度(617bp)与预期结果相符,表明该菌基因组结构中存在tcpA基因。同时采用电镜技术检测TCP,观察到细菌表面存在数量不一,中空、短粗的菌毛。这与国内外报道的霍乱弧菌TCP形态相吻合[8~13]。从而证实了拟态弧菌HX4菌株为TCP+株,在一定的营养与培养条件下可以表达TCP。 其次,采用细菌学方法结合电镜技术优化拟态弧菌HX4菌株高表达TCP的最佳营养与培养条件。结果显示培养基的种类(AKI、CFA、BHI和LB)、培养温度(4℃、20℃、30℃和37℃)和培养方式(静置、厌氧和振荡培养)等环境参数对TCP表达均有明显影响,其最佳表达条件是:细菌接种初始pH 6.7定居因子固体培养基(CFA),30℃需氧静置培养24h。 再次,采用菌毛分离技术、盐析技术和聚丙烯酰胺凝胶回收技术建立了拟态 WP=4 弧菌HX4菌株TCP的提纯方法。研究中比较了四种不同脱菌毛缓冲液的洗脱分离菌毛的效果,结果显示含2mol/L尿素的0.01mol/L, pH7.2的PBS缓冲液的洗脱效果最佳,其菌毛分离液中蛋白浓度最高,电泳条带最清晰。在此基础上进一步比较了3种不同饱和浓度硫酸铵(30%、50%和70%)盐析沉淀蛋白的效果,结果显示硫酸铵饱和度为70%时粗提蛋白含量最高,硫酸铵饱和度为30%时粗提蛋白含量最低。而PAGE电泳结果显示3份粗提蛋白样品的电泳图谱无明显差异。虽然经30%饱和硫酸铵盐析沉淀所得的总蛋白浓度较低,但其目的蛋白浓度相对较高,杂蛋白相对较少。因此,我们认为盐析沉淀TCP蛋白的最佳饱和硫酸铵浓度为30%。随后采用聚丙烯酰胺凝胶回收法回收纯化蛋白并进行电镜检查,确定了TCP蛋白在凝胶上的位置及其相对分子量为20.14KD。 最后,应用细胞模型、肠管组织模型、动物试验和血凝试验系统研究了拟态弧菌HX4菌株TCP的生物学特性。以粘附模式细胞HEp-2细胞作为细胞模型,以本种动物河蟹肠管作为组织模型,测定拟态弧菌HX4菌株的组织细胞粘附性。结果显示TCP+菌和TCP-菌对河蟹肠管的粘附率分别为32.2%和0.4%;对细胞平均粘附菌数分别为16.03±4.669(﹥10)和6.8±2.06(﹤10),前者是粘附阳性菌,后者则为粘附阴性菌。表明HX4菌株对组织细胞的粘附作用主要是由TCP所介导,TCP是拟态弧菌的一种重要粘附因子。细菌毒力试验结果显示TCP+菌对小鼠和河蟹的LD50分别是1.7×107CFU/mL和2.08×106CFU/mL;而TCP-菌对小鼠和河蟹的LD50分别为2.13 ×108 CFU/mL和2.09×107CFU/mL,TCP+菌的毒力较大,约为TCP-菌的10-12倍。表明TCP也是拟态弧菌的一种重要毒力因子,通过介导细菌粘附组织细胞和协同毒素基因的表达参与致病过程。免疫保护性试验结果显示TCP抗体可以保护100%免疫小鼠和80%河蟹抵抗50LD50菌体的攻击。表明TCP蛋白又是一种有效的保护性抗原,诱导机体产生的TCP抗体可保护河蟹抵抗拟态弧菌的感染。提示我们可以研制TCP疫苗,预防水产动物的弧菌病。采用玻片血凝试验和微量血凝试验测定TCP+菌对不同动物红细胞的血凝谱及血凝价,结果显示TCP+菌的血凝谱较窄,仅对鸡和O型人的红细胞具有凝集作用,凝集价分别为1:16和1:64。同时发现TCP-菌也具有微弱血凝性。表明除TCP作为一种主要血凝素外,还有外膜蛋白等其它血凝素参与凝集作用。 综上所述,拟态弧菌HX4菌株为TCP+株,TCP蛋白的相对分子量为20.14KD,具有致病性、组织细胞粘附性、免疫保护性和血凝性等生物学特性。


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