查尔酮合酶基因RNAi表达载体构建及矮牵牛遗传转化研究

【摘要】：RNA 干涉是一种重要的基因沉默方式,它在基因功能和遗传改良研究中有重要的应用。本文利用短干涉 RNA(short interference RNA,siRNA)进行了矮牵牛查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因短干涉 RNA 片段表达载体的构建,研究了矮牵牛再生体系和基因枪介导、农杆菌介导遗传转化体系,并进行矮牵牛 CHS 基因的 RNAi 载体转化研究。得到如下结果: 1.构建了两个抑制矮牵牛查尔酮合成酶(CHS)基因表达的 RNAi 表达载体pBI121-CHS。该载体含有的目的片段为反向重复序列,转录后反向复序列相互配对,形成小发卡 RNA(shRNA),在受体细胞内经加工、处理成为 21nt 的类 siRNA 分子,启动 RNA 干涉。 2.建立了成熟的矮牵牛再生体系。通过正交试验,研究了不同激素水平下对矮牵牛再生体系的诱导效应,确定诱导愈伤组织的最适宜培养基为: MS + 2,4-D 2.0(mg/L)+ 6-BA0.1(mg/L)+ KT0.1(mg/L)+ NAA0.1(mg/L);诱导不定芽分化的最适宜培养基为:MS + 6-BA1.0(mg/L)+ KT0.2(mg/L)+ NAA0.3(mg/L);诱导生根的最适宜培养基为:MS + NAA 0.4(mg/L)+ IBA1.0(mg/L)。 3.确定了卡那霉素(Kan)对矮牵牛幼苗的适宜筛选浓度。通过矮牵牛对照株对不同浓度 Kan 的敏感性试验,得出适宜的筛选浓度为 80mg/L。利用此浓度,可对转化后矮牵牛植株进行抗性筛选。 4.初步建立了基因枪介导的转基因体系。研究了不同轰击距离和次数对转化效果的影响,确定了适宜的基因枪轰击参数为轰击距离:60mm,轰击次数:1 次。最终获得基因枪介导矮牵牛抗性苗 4 株,抗性苗再生率 4%。 5.初步建立农杆菌叶盘法介导转基因体系。研究了不同农杆菌菌液浓度和侵染时间对矮牵牛无菌苗叶盘分化率的影响,确定适宜的菌液感染浓度 OD_(600)=0.5,侵染时间5min。最终获得农杆菌介导矮牵牛抗性苗 7 株,抗性苗再生率 6%。 6.通过对矮牵牛抗性苗 PCR 及 Southern 杂交分子检测,进一步证明外源基因已整合至矮牵牛基因组中。共获得基因枪及农杆菌介导矮牵牛转基因株 3 株。 7.观察对比 Southern 杂交验证株与未转化植株在田间花色表现,可以看出,转基因株与对照株相比,花色变浅,花脉部有轻微白色斑点条纹。可初步判定外源干涉片段已整合进入矮牵牛基因组并对花色表现产生干涉效应。 综上所述,本文率先将 siRNA 片段用于矮牵牛 CHS 基因干涉作用的研究,通过RNA 干涉载体构建、矮牵牛再生体系和转化方法的研究,初步建立起一套较为成熟的RNA 干涉遗传转化体系,为今后 RNA 干涉技术在植物品质改良中的研究和应用提供了依据。