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酵母双杂交技术筛选与p53蛋白相互作用的蛋白质研究

苏桂英  
【摘要】: 肿瘤抑制基因p53位于人类17号染色体的短臂上,其转录翻译编码的野生型p53蛋白由四部分组成:N-端转录激活区,DNA结合区,寡聚化区域和C-端调控区。在人类50%以上的肿瘤组织中均发现了p53基因的突变。p53可以调控下游多种基因表达,其功能主要表现在阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组稳定性和抑制肿瘤血管生成四个方面。 P53蛋白是一种重要的肿瘤抑制因子,作为转录因子在转录网络之中发挥核心作用。它的功能多发生在蛋白水平上,这些转录后修饰包括泛素化、磷酸化、sumo化、甲基化、乙酰化等。 为了进一步研究p53蛋白在肿瘤治疗研究中的作用,本文采用酵母双杂交技术筛选与p53蛋白相互作用的蛋白质。酵母双杂交(yeast two hybridization)是研究蛋白质相互作用的最有效方法之一。这个技术的产生是基于对酵母转录因子GAL4性质的认识。由于p53蛋白是转录因子,我们将其转录激活区(1-62aa)缺失,以p53蛋白的62-393aa作为诱饵。以p53和大T抗原为阳性对照,以大T抗原和Laminc为阴性对照,对人乳腺文库进行筛选,寻找与之相互作用的蛋白质,为深入研究p53的功能提供新的线索。结果如下: 1.运用PCR方法成功扩增出了目的基因片段:p53(62-393aa),并插入到PGBKT7载体上,测序证明无移码和错码,保证了读码框的完整性。 2.将PGBKT7-p53(62-393aa)转化到酵母细胞后,提取蛋白质,进行western blotting检测,蛋白质表达且大小正确。 3.通过自身转录激活测试系统表明,PGBKT7-p53(62-393aa)片段没有自身转录激活活性,可以进行酵母双杂交筛选。 4.完成了大量的筛选验证工作,从人乳腺文库中获取了与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质PIAS3,它可能为p53的功能研究提供重要的线索。 5.从人乳腺文库中钓取了PIAS3基因cDNA,并测序正确。 6.将PIAS3基因cDNA克隆至原核表达载体PGEX-KG上,并且表达出融合的原核蛋白质。


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