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鸡防御素基因的克隆、组织分布及Gal-2基因的原核表达

孙洁  
【摘要】: 为了对鸡基因组中防御素基因的序列和表达情况进行研究。本实验选取不同日龄的来航鸡为研究对象,应用分子克隆技术,分别设计了13对特异性引物对鸡体内的13种防御素基因片断进行克隆和序列分析,成功克隆了Gal-1~Gal-12基因,并研究了其在脑、心脏、法氏囊、脾脏、肾脏、肺脏、肝脏、骨髓组织中分布情况。利用麦芽糖结合蛋白表达系统pMAL-c_2X质粒表达系统对Gal-2基因进行成功表达,经IPTG诱导得到麦芽糖结合蛋白,为下一步纯化目的蛋白,研制开发抗生素替代品提供科学的理论和实践基础。 1.鸡防御素基因的克隆及组织分布 应用Trizol Reagent试剂盒RNA抽提法,对鸡的脑、心脏、法氏囊、脾脏、肾脏、肺脏、肝脏、骨髓进行RNA抽提,经2.0%琼脂糖凝胶电泳后出现28_s和18_sRNA两条清晰的条带。分光光度计检测其RNA在260hm和280nm时的0D值,计算鸡RNA OD260/OD280值均在1.9左右。实验所得RNA纯度高,满足实验要求。 根据Genbank登录的Gal-1~Gal-13的基因序列,设计了十三对特异性引物,运用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,首先反转录合成鸡的13个防御素基因的cDNA第一链,然后进行PCR扩增。Gal-1~Gal-12基因的RT-PCR产物均出现特异性条带。测序结果进行BLAST比对结果显示:与报导的序列基本一致,同源性均在95%以上,且每个序列都包括完整的开放阅读框在内,为以后利用巢氏PCR进行进一步扩增表达做好了准备。首次在国内报导的Gal-4~Gal-12的基因序列。 用十三对特异性引物对从八个组织中提取的RNA反转录的cDNA链进行PCR扩增,Gal-1~Gal-12在各个组织中均有分布,骨髓中有Gal-1~7表达,肾脏中有Gal-9~11表达,肝脏中有Gal-1和Gal-8~10表达,脑组织中仅有Gal-5表达,心脏中也只有Gal-12表达,法氏囊中有Gal-1和Gal-3表达,脾脏中只有Gal-1表达,肺脏中有Gal-1~3和Gal-10表达。Gal-13在以上八个组织中未发现存在,表明可能防御素的分布存在着品种及个体差异,具体原因还有待于进一步的研究。 2.鸡Gal-2基因的克隆及鉴定及表达 为了便于对鸡Gal-2基因进行表达,在Gal-2的引物P_1、P_2的5′、3′端设计了EcoRⅠ、XbaⅠ酶切位点和相应的保护碱基。首先将鸡Gal-2基因的RT-PCR产物纯化,插入到克隆载体pGEM-T Easy的多克隆位点中,构建重组质粒pGEM-T-Gal-2,转化大肠杆菌DH5α,Amp抗性筛选,得到阳性克隆质粒。并将该阳性克隆质粒进行PCR鉴定,电泳得到约195bp大小的特异性条带,重组质粒构建成功。然后将pMAL-c_2X质粒进行双酶切,然后将Gal-2片断插入到经过双酶切的pMAL质粒中,构建了表达载体pMAL-c_2X-Gal-2,菌落PCR鉴定挑出阳性转化子,将阳性转化子增菌后用IPTG进行诱导表达,运用SDS-PAGE电泳鉴定融合蛋白已经表达。 以上研究表明:本实验利用现代分子学技术对在鸡体内的新型抗菌肽-防御素进行了成功克隆,并对起在鸡体内一些主要组织中的分布情况进行一些基础研究;在Gal-2基因成功克隆的基础上,将其基因片断成功导入并构建克隆载体DGEM-T-Gal-2和表达载体pMAL-c_2X-Gal-2,用IPTG进行了成功诱导表达。


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