抗口蹄疫病毒单克隆抗体的制备和抗原模拟表位的筛选

【摘要】： 口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的主要侵害偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病。口蹄疫病毒是小RNA病毒科口蹄疫病毒属的唯一成员,不含囊膜的病毒粒子包含有一个单链正股RNA基因组。目前OIE将其划分为七个血清型,分别命名为O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3。然而,研究者通过血清学试验发现,口蹄疫七个血清型的分离株存在广泛的抗原变异,每个血清型都含有众多亚型。在发展中国家,控制口蹄疫的关键是快速准确地诊断和使用有效的疫苗。因此,研发快速诊断试剂和高效疫苗,对口蹄疫的防控具有十分重要的现实意义。 单克隆抗体有着特异性强、重复性好的特点,可开发成诊断试剂及应用于各项基础研究。为制备抗O型口蹄疫病毒特异性单克隆抗体,用纯化的O型口蹄疫病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选和间接免疫荧光(IFA)验证,三次有限稀释法克隆,获得了3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为289、5F7和8E8,抗体亚类鉴定其均为IgG1/κ类型;间接ELISA测定,3株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1:256、1:512和1:512,小鼠腹水效价分别为1:8×10~3、1:1.6×10~4和1:1.6×10~4;型特异性检测结果显示,三株单克隆抗体仅与O型FMDV反应,不与Asia1型FMDV反应,推测它们均为抗O型FMDV的血清型特异性单克隆抗体;Western blot分析表明,单克隆抗体289和5F7与O型FMDV均没有特异性反应条带出现,表明它们所针对的抗原表位均为构象型表位;单克隆抗体8E8与病毒抗原有特异性反应条带,所以它识别线性表位。相加ELISA试验表明,289与5F7两株单克隆抗体识别的抗原表位相近或相同,但均不同于单克隆抗体8E8的识别表位;中和试验显示单克隆抗体8E8具有很强的中和活性,中和效价为1:1024。经硫氰酸盐洗脱法测定,289和5F7的相对亲和力指数均为1.5mol/L,8E8的相对亲和力指数为2.5mol/L。这3株单克隆抗体的获得,为研究O型口蹄疫病毒提供了重要的实验材料。 抗原表位,又称抗原决定簇,是抗原分子抗原性的基础。正确而详细地绘制抗原表位图谱对疾病的诊断、设计无毒副作用的多表位疫苗以及免疫治疗试剂等具有积极的意义。为研究Asia1型口蹄疫病毒的抗原表位性质,对本实验室制备的一株抗Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体3E11的识别表位进行鉴定。3E11为一株识别构象型表位的具有很强中和活性的单克隆抗体,利用噬菌体随机十二肽库对单克隆抗体3E11进行4轮淘选,前三轮采用固相吸附法淘洗,最后一轮淘洗采用蛋白G液相吸附法;经噬菌体ELISA鉴定,获得8个阳性噬菌体克隆,这些克隆与单克隆抗体3E11均发生特异性反应;序列测定及比对显示,5个噬菌体克隆的展示肽含有一致基序GSLxxL(x代表任意氨基酸),所以单克隆抗体3E11识别抗原表位的基序为GSLxxL,为单克隆抗体3E11识别的模拟表位;合成含基序的一种十二肽和该十二肽的随机打乱肽,肽ELISA显示该十二肽具有结合单克隆抗体3E11的活性,而随机打乱肽不能结合单克隆抗体3E11;分别合成肽对基序的氨基酸残基进行定点突变显示,这些氨基酸残基对于单克隆抗体3E11识别表位的抗原活性均为关键性的;肽竞争ELISA显示,该模拟表位能够抑制单克隆抗体3E11与病毒抗原的结合。 总之,本研究成功制备了3株针对O型FMDV的单克隆抗体,并且鉴定了Asia1型FMDV的一个模拟表位,这些研究将为口蹄疫病毒新型疫苗研制和诊断试剂开发奠定基础。