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泛素连接酶Hrd1促进α1-抗胰蛋白酶Z突变体降解及细胞存活

王海萍  
【摘要】:α1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin, AAT)主要由肝细胞合成,分泌到血液中,它是血清中的主要蛋白酶抑制剂,其作用主要是保护肺组织免受蛋白酶水解,尤其是中性粒细胞弹性蛋白酶的水解破坏。AAT缺乏症是一种常染色体隐性遗传病,发病率约1/2000~5000,它的典型临床表现是早发性肝脏疾病和肺气肿。AAT缺乏症是由于编码AAT蛋白的基因突变引起AAT分泌障碍所致,最常见的引起AAT缺乏症的突变为Z型突变,占临床病例的95%以上,该突变编码的蛋白为AAT Z突变体(α1-antitrypsin Z variant, ATZ)。在前期研究中我们发现ring-finger结构域家族泛素连接酶(Ubiquitin ligase, E3) gp78可以促进ATZ降解,本研究进一步观察另一种ring-finger结构域家族E3,Hrd1对ATZ水平的影响。 目的: 观察Hrd1是否可以促进ATZ的降解,并探讨其降解的机制。同时观察Hrd1介导的ATZ降解是否影响细胞的功能。 方法: 构建ATZ、Hrd1、Hrd1的E3活性突变体Hrd1C1A等真核表达质粒,合成siRNA-Hrd1,转染HEK 293T或HepG2细胞;逆转录聚合酶联反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)和免疫印迹(Immune Blot, IB)检测mRNA及蛋白水平的变化;流式细胞检测细胞荧光强度的变化;放线菌酮(cycloheximide, CHX)示踪、蛋白酶体抑制实验观察Hrd1对ATZ表达水平影响的作用机制;免疫细胞化学和免疫荧光观察细胞形态和蛋白定位;免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)和蛋白片段互补实验(protein fragment complementation assay, PCA)确定Hrd1和ATZ的相互作用;荧光显微镜观察和原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL)染色检测细胞形态和凋亡情况。 结果: 1.Hrd1表达降低细胞内ATZ的总体水平 HEK 293T细胞共转染ATZ和Hrd1的cDNA,设立ATZ共转染空载体对照,24 hrs后用Triton X-100裂解液裂解细胞并离心,IB检测裂解液上清。与对照组相比,共表达Hrd1后ATZ在上清中的总量变化不明显,但高分子量ATZ水平明显降低。由于高分子量蛋白聚集体容易形成不溶性沉淀,我们推测Hrd1可能增加ATZ的可溶性并降低沉淀中ATZ水平。为了验证这一设想,我们用IB分别检测细胞上清和沉淀中的ATZ,结果发现Hrd1能明显降低沉淀中ATZ的水平。 2.下调内源性Hrd1表达能稳定细胞内ATZ水平 利用siRNA技术,合成siRNA-Hrd1寡聚核苷酸,并将ATZ和siRNA-Hrd1共转染HEK 293T细胞,同时设立阴性对照。IB结果显示,与对照组相比,siRNA-Hrd1能使细胞内ATZ水平增高,尤其是SDS不溶部分的ATZ水平。 3.Hrd1降低细胞内ATZ水平与E3活性有关 Hrd1属于ring-finger结构域家族E3,它的E3活性依赖其指环结构的完整性。为了观察细胞内ATZ水平的降低是否与Hrd1的E3活性有关,我们分别观察野生型Hrd1和E3活性缺失体Hrd1C1A对细胞内ATZ水平的影响。HEK 293T细胞共转染ATZ与Hrd1或Hrd1C1A的cDNA,24 hrs后免疫细胞化学结果显示,野生型Hrd1表达多的细胞,ATZ聚集减少。但Hrd1C1A表达多的细胞,ATZ聚集未见减少。IB结果同样显示,Hrd1明显降低沉淀中ATZ水平,而Hrd1C1A对沉淀中ATZ水平无明显影响。上述结果提示:Hrd1降低细胞沉淀中ATZ水平是其E3活性依赖的。 4.Hrd1促进ATZ的降解 细胞内蛋白水平受合成和降解两方面因素影响,合成减少或/和降解增加均可以导致蛋白总体水平的降低。为了观察Hrd1引起的细胞内ATZ水平的降低是否是由于ATZ的降解增加所致,我们使用了CHX (100μg/ml)抑制蛋白质合成,然后观察加入CHX后不同时间细胞内ATZ的水平,以此来了解ATZ的降解情况。结果发现,Hrd1能明显促进SDS不溶部分ATZ的降解。同时还发现,共表达Hrd1的细胞培养上清液中ATZ的分泌减少,这进一步说明,细胞内ATZ的减少不是因为它的分泌增加,而是因为它的降解增加所致。 5.Hrd1促进ATZ降解依赖其E3活性 为了进一步明确Hrd1介导ATZ的降解是否与其E3活性有关,我们分别将HEK 293T细胞共转染ATZ和Hrd1或Hrd1C1A的cDNA,24 hrs后在细胞的培养上清液中加入CHX,然后检测各时间点细胞内的ATZ水平。结果发现,Hrd1C1A能增加ATZ的可溶性,但不能促进SDS不溶部分ATZ的降解。提示Hrd1介导的ATZ降解与其E3活性有关。 6.Hrd1增加ATZ的泛素化 细胞内的蛋白降解主要有两种途径:泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasomepathway, UPP)和溶酶体途径。由于Hrd1是一种ring-finger结构域家族的E3,我们首先考虑Hrd1通过UPP途径促进ATZ的降解。内质网中的蛋白底物经过UPP降解时首先被泛素化修饰,然后经过逆向转运到达26S的蛋白酶体,被蛋白酶体中的蛋白水解酶降解。为了明确UPP是否参与了Hrd1介导的ATZ降解,我们观察了Hrd1对ATZ泛素化的影响。结果发现在没有蛋白酶体抑制剂MG132存在的情况下,Hrd1可明显降低多聚泛素化ATZ;在细胞的培养上清液中加入MG132,作用4 hrs后收集细胞,共转染ATZ和野生型Hrd1组出现多聚泛素化ATZ,而单独转染ATZ或者共转染ATZ与Hrd1C1A组则没有观察到明显的ATZ泛素化。该结果提示Hrd1可以促进ATZ的泛素化,这种作用也是E3活性依赖的。 7.含缬酪肽蛋白(valosin-containing protein,VCP)参与Hrd1介导的ATZ降解 ATZ是内质网(endoplasmic reticulum, ER)腔内的蛋白,如果经过UPP降解,需要从ER逆向转运至细胞浆,然后由26s蛋白酶体降解,即所谓的内质网相关蛋白降解(ER-associated degradation, ERAD)。在ERAD过程中,VCP在蛋白底物由ER转运至细胞浆的逆向转运中起着重要的作用。我们进一步观察了VCP是否也参与Hrd1介导的ATZ降解。我们共转染ATZ,Hrd1和VCP的突变体VCPQQ的cDNA。结果显示,与对照组相比,VCPQQ阻碍了Hrd1介导的ATZ降解,提示VCP参与了Hrd1介导的ATZ的降解。 8.溶酶体通路可能参与Hrd1介导的ATZ降解 为了观察溶酶体通路是否参与Hrd1介导的ATZ降解,我们共转染ATZ和Hrd1,观察溶酶体膜稳定剂氯化铵对ATZ水平的影响,发现加入氯化铵后,出现高分子量ATZ的聚集。我们同时构建了在ATZ的信号肽前方加入带有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)标签的ATZ表达载体,改变ATZ在细胞内质网中的定位。将表达GFP-ATZ和Hrd1的质粒共转染HEK 293T细胞,设立共转染GFP-ATZ和空载体、GFP和Hrd1及GFP和空载体的对照。24 hrs后荧光显微镜观察,与对照组相比,共转染Hrd1组GFP-ATZ绿色荧光强度明显降低;流式细胞检测同样发现,共转染Hrd1后,GFP-ATZ的荧光强度降低。而在转染GFP的对照组中,Hrd1对GFP的荧光强度没有明显影响,IB结果也显示Hrd1不能降低细胞上清和沉淀中GFP的表达水平。 9.Hrd1和ATZ存在相互作用 前述实验结果提示Hrd1可以通过UPP促进ATZ的降解。我们进一步观察了ATZ与Hrd1之间是否存在相互作用。共转染ATZ和Hrd1或Hrd1C1A的cDNA,免疫荧光双标结果显示ATZ与Hrd1在细胞内存在共定位。免疫共沉淀结果提示ATZ与Hrd1及Hrd1C1A均存在直接的相互作用,该结果提示ATZ与Hrd1的相互作用与其E3活性无关。为了进一步证实ATZ和Hrd1之间的相互作用,我们构建载体,将ATZ和Hrd1的N端分别连上荧光素酶的C端和N端。PCA实验观察共表达两种重组载体的细胞的荧光素酶活性。与对照组相比,实验组荧光素酶活性明显增高。该结果进一步证实Hrd1和ATZ之间存在相互作用。 10.Hrd1降低ATZ的细胞毒作用 ATZ的聚集可以引起肝细胞毒性,我们在体外HEK 293T和HepG2的细胞模型中同样观察到ATZ具有细胞毒作用。同时我们观察了Hrd1介导的ATZ降解对ATZ细胞毒作用的影响。免疫荧光结果显示单独表达ATZ的细胞或者共表达ATZ与Hrd1C1A的细胞变圆、突起缩短、细胞核分叶、固缩、碎裂或消失;共表达Hrd1后,细胞形态和细胞核趋于正常。统计分析ATZ阳性细胞核的完整性结果显示,Hrd1的表达有助于维持ATZ阳性细胞核的正常形态;TUNEL染色结果同样显示共表达Hrd1后,细胞凋亡减少,而Hrd1C1A没有这种作用;提示Hrd1可以降低ATZ的细胞毒作用,这种作用是E3活性依赖的。 结论: 以上研究结果表明,Hrd1作为E3不仅可以通过UPP促进ATZ降解,而且溶酶体通路可能参与了Hrd1介导的ATZ降解,并且Hrd1可增加ATZ的可溶性,从而降低ATZ的细胞毒作用,促进细胞存活。该研究结果可能为AAT缺乏症肝脏并发症的治疗提供潜在的药物靶点。


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