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兔同种异体脱钙骨复合骨髓间充质干细胞体外培养的成软骨观察

钱三祥  
【摘要】:目的1.探讨体外进行兔骨髓间充质干细胞(BMSC)的分离、培养和鉴定的方法,为下一步组织工程软骨构建奠定基础。2.研究兔骨髓间充质干细胞(BMSC)复合同种异体脱钙骨(DBM)在诱导液刺激下体外培养形成软骨。 方法1.采用同源雄性新西兰幼兔(4~6周龄)全骨髓贴壁筛选法培养原代BMSC,传代至第二代细胞时部分标本行流式细胞表型鉴定,第三代细胞融合至约80%时培养基中加入成软骨诱导液:含转化生长因子(Transforming Growth Factor,TGF)-β1 10ng/ml、胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor,IGF)-Ⅰ20ng/ml、维生素C 50ng/ml,取诱导14d后以及诱导前的细胞进行爬片并做Ⅱ型胶原免疫组化。2.根据Urist提供的方法制作DBM,用电镜观察DBM内部结构。3.将诱导后的BMSC种植于DBM支架进行体外培养,于4、8、12周分别取材,行大体形态观察并制石蜡切片行苏木素伊红染色(Hematoxylin-Eosin Staining,HE)、甲苯胺蓝(Toluidine Blue,TB)染色、Masson染色、Ⅱ型胶原免疫组化等组织学观察。 结果1.本实验方法分离和培养的MSCs形态特征明显,均呈梭形,原代培养10~14天细胞融合约90%,增殖传代的细胞6~7天可达90%融合。所培养的细胞经流式细胞仪鉴定,CD44(+),CD34(-)。MSCs经定向诱导后表现出软骨细胞的特性。2.制备得到的DBM为三维立体疏松多孔的海绵样结构,电镜显示DBM内部的孔隙结构并相互交通。3.诱导后的BMSCs与DBM复合培养12w后,取出行组织学切片观察及Ⅱ型胶原免疫组化观测:HE染色见软骨细胞增生,胞核染色呈蓝色;甲苯胺蓝染色见软骨细胞排列无序,周围基质包绕;Masson染色见阳性,见软骨细胞排列无序;Ⅱ型胶原免疫组织化学反应见细胞胞浆和外基质中出现棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色阳性。 结论1.应用贴壁细胞筛选法可获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,体外给予TGF-β1和IGF-Ⅰ可促进MSCs增殖和成软骨分化;2.MSCs与同种异体DBM结合后可在体外成功培养出组织工程软骨;3.作为“同种异体骨复合外周血干细胞关节腔内培养工程软骨”的系列研究的一部分,本实验为过渡到下一阶段“体内成软骨研究”奠定了良好基础,并为后续研究提供了良好的支撑和对照。


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