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褪黑素提高肝癌细胞对内质网应激诱导的细胞凋亡通路的敏感性

高金锁  
【摘要】:背景:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见恶性肿瘤之一,在所有人类肿瘤中约占6%,其发生率在全世界范围正在上升。肝癌患者总的生存期极短,5年生存率低于10%。凋亡抵抗是肝癌治疗失败的重要原因,凋亡抵抗是肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的特征之一,在HCC发生发展中占有重要地位。凋亡抵抗产生的原因非常复杂。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)可以导致细胞凋亡,但在ERS下肿瘤细胞发生凋亡并不明显,表明肿瘤细胞可能对ERS产生适应并逃避凋亡。有研究发现,在使用ERS诱导剂衣霉素(Tunicamycin, TM)和布雷菲德菌素(Brefeldin A)可导致乳腺癌MCF-7细胞的COX-2表达上调。而研究发现环氧化酶-2(cycloxygenase-2, COX-2)有明显的抑制凋亡作用,已引起人们的广泛关注。本研究应用ERS诱导剂TM诱导人肝癌细胞株HepG2及人正常肝细胞HL-7702发生ERS,观察其增殖抑制率及细胞凋亡率的变化。检测肝癌细胞发生ERS后COX-2表达的变化,探讨肝癌细胞抵制ERS反应性凋亡途径的可能机制。COX-2转录活性、过度表达水平和延续时段,主要受内转录调控程序和内源性因子,如褪黑素(MT)和干扰素(interferon,INF)等控制。其中,MT把COX-2作为靶分子控制其转录和表达,成为COX-2特异性阻滞剂。所以我们选用COX-2特异性阻滞抑制褪黑素抑制COX-2的表达,观察肝癌细胞ERS后的增殖抑制率及细胞凋亡率的变化。为HCC的治疗找到更多的方法。 目的:了解ERS诱导肝癌细胞的凋亡情况及其作用机制,并探讨褪黑素在肝癌细胞抵制ERS诱导的细胞凋亡中的作用。 方法:MTT法检测药物作用于人肝癌细胞株HepG2及人正常肝细胞株HL-7702的增殖抑制情况,流式细胞仪PI单染法检测细胞周期DNA含量分析凋亡率,TUNEL法观察药物作用细胞后凋亡细胞形态及各组凋亡率差别,Wertern Blot检测TM诱导的COX-2和GRP 78蛋白表达情况。 结果: 1. TM及加入褪黑素作用时TM对人肝癌细胞株HepG2和人正常细胞株HL-7702增殖抑制作用 1.1 TM对HepG2细胞的增殖抑制作用 采用MTT法,观察TM对HepG2细胞的增殖抑制作用。结果显示不同浓度(1.5,3,6,9,12umol/L)TM作用于HepG2细胞后其抑制细胞增殖作用并不明显,12umol/L TM作用48h后增殖抑制率仅达到27.2%。 1.2 TM对HL-7702细胞的增殖抑制作用 采用MTT法,观察TM对HL-7702细胞的增殖抑制作用。结果显示不同浓度(1.5,3,6,9,12umol/L)TM作用于HL-7702细胞后明显抑制细胞增殖作用。1.5umol/L TM TM作用48h后增殖抑制率可达50.9%。 1.3应用褪黑素时TM对HepG2细胞的增殖抑制作用 采用MTT法,观察褪黑素作用时TM对HepG2细胞的增殖抑制作用。结果显示应用褪黑素,HepG2对TM诱导的内质网应激诱导的细胞凋亡的敏感性提高,12umol/L TM作用48h后增殖抑制率上升至64.9%。 1.4应用褪黑素时TM对HL-7702细胞的增殖抑制作用 采用MTT法,观察褪黑素作用时TM对HL-7702细胞的增殖抑制作用。结果显示应用褪黑素及TM组HL-7702细胞与单用TM组的增殖抑制率未见明显差异。 2. TM以及加入褪黑素时TM诱导的ERS对HepG2和HL-7702凋亡的影响 2.1 TM以及加入褪黑素时TM诱导的ERS对HepG2和HL-7702凋亡影响的TUNEL分析 2.1.1 TM以及加入褪黑素时TM诱导的ERS对HepG2凋亡影响的TUNEL分析 采用末端双脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)观察HepG2和HL-7702细胞凋亡的形态学改变。研究发现对照组细胞及单用褪黑素组细胞增殖旺盛,仅见少许凋亡细胞;单用TM作用48h后,细胞密度稍见减少,可见少许凋亡细胞;加入褪黑素时TM作用48h后,可见细胞密度明显减少,凋亡细胞数明显增加。 2.1.2 TM以及加入褪黑素时TM诱导的ERS对HL-7702凋亡影响的TUNEL分析 研究发现对照组细胞及单用褪黑素组细胞增殖旺盛,仅见少许凋亡细胞;而单用TM细胞组及加入褪黑素及TM细胞组作用48h后,细胞密度均见明显减少,凋亡细胞数明显增加。 2.2 TM以及加入褪黑素时TM诱导的ERS对HepG2和HL-7702凋亡影响的FCM检测 2.2.1 TM以及加入褪黑素时TM诱导的ERS对HepG2凋亡影响的FCM检测 应用流式细胞仪(Flow Cytometry,FCM)检测细胞凋亡率。在DNA图谱G_0/G_1期前出现了一个代表细胞凋亡的亚G_1峰即凋亡峰。FCM结果显示,正常对照组可见低矮的凋亡峰,单用TM及单用褪黑素细胞组作用48h后,其凋亡峰未见明显变化。当加入褪黑素时,在TM诱导48h后,其凋亡峰增加。 2.2.2 TM以及加入褪黑素时TM诱导的ERS对HL-7702凋亡影响的FCM检测 FCM结果显示,正常对照组可见低矮的凋亡峰,单用褪黑素细胞组作用48h后,其凋亡峰未见明显变化。在TM及加入褪黑素时TM诱导48h后,其凋亡峰增加。 3.肝癌细胞抵制ERS诱导的细胞凋亡的可能分子机制 采用Wertern Blot检测TM诱导的COX-2和GRP 78蛋白表达情况。结果表明,ERS诱导剂TM可诱导GRP78的表达增多,ERS的产生可诱导COX-2表达增多。褪黑素抑制肝癌细胞中ERS诱导的COX-2表达。 结论 褪黑素提高肝癌细胞对内质网应激诱导的细胞凋亡通路的敏感性


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