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肺炎克雷伯菌ESBLs检测和KPC酶分析

孙红  
【摘要】:研究背景和目的: 随着广谱抗菌药物的广泛应用,尤其是三代头孢菌素的大量应用,产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases, ESBLs)的肺炎克雷伯菌分离率有逐年增加之势。ESBLs主要由革兰阴性杆菌产生,是质粒介导的能水解多种β-内酰胺类抗生素的一类酶。ESBLs可通过接合、转化、转导等形式使耐药基因在细菌间扩散,造成严重的院内感染和耐药菌株的广泛传播。肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素非常敏感,然而随着碳青霉烯类抗生素(亚胺培南、美罗培南等)使用增多也出现了耐药菌株。肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemases, KPC)是近来新发现的一类碳青霉烯酶,能够水解包括碳青霉烯类抗生素等多种β-内酰胺类抗菌药物,并且KPC基因位于可转移性质粒上,使得KPC在菌株间传播。临床实验室应重视对产ESBLs和KPC菌株的检测和流行病学监测,防止并控制由其引起的医院感染的暴发流行。本研究旨在了解我院肺炎克雷伯菌耐药性和产ESBLs的发生率、最佳筛选底物,并对亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌进行了KPC耐药基因型检测和分析,明确其耐药机制,为临床合理使用抗生素提供依据。 方法: 对2009年1月-2010年10月蚌埠医学院第一附属医院临床分离出的124株肺炎克雷伯菌感染情况进行回顾性调查,并用WHONET5.4软件进行药敏分析,明确其感染现状和耐药情况。选用头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南、头孢曲松进行ESBLs表型初筛,双纸片协同确证试验检测产ESBLs菌株。通过改良Hodge实验(Modified Hodge Test, MHT)初筛产KPC酶肺炎克雷伯菌。聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)和测序鉴定耐药肺炎克雷伯菌是否带有KPC基因,并通过网上GenBank的比对确定KPC基因型。用脉冲场凝胶电泳( pulsed-field gelelectrophoresis, PFGE)技术对KPC阳性菌株进行同源性分析。质粒转移接合试验确定KPC基因是否可以进行质粒转移。质粒转移后的接合子和原始的临床菌用琼脂稀释法检测碳青霉烯类抗生素的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。 结果: 肺炎克雷伯菌的分布以ICU的检出率较高,占17.74%,感染部位以呼吸道为主,占37.90%。实验证明我院ESBLs最佳筛选底物是头孢噻肟,灵敏度高达95.5%,单用头孢他啶作为筛选底物时漏检率最高。124株肺炎克雷伯菌共检出产ESBLs 42株,阳性率为33.87%。产ESBLs菌株对抗菌药物的耐药率明显高于非产ESBLs菌株。124株肺炎克雷伯菌中有13株(10.48%)出现了亚胺培南耐药。改良Hodge实验初筛出10株肺炎克雷伯菌产KPC(76.92%),经过PCR确证,有2株肺炎克雷伯菌KPC阳性(15.38%),测序结果表明,它们均属于KPC-2型碳青霉烯酶基因。PFGE结果显示我院这2株细菌来源于同一克隆。接合试验发现,接合菌获得了碳青霉烯类抗生素耐药基因,但与原始临床菌株相比,接合子对碳青霉烯类抗生素的MIC值有所降低。 结论: 呼吸道感染是我院肺炎克雷伯菌感染的主要途径,临床应重视空气环境细菌学监测;产ESBLs是肺炎克雷伯菌对青霉素类、三代、四代头孢菌素类抗生素高耐药的主要原因;产KPC是导致肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素耐药原因之一。本次研究在蚌埠地区首次分离出携带有KPC-2型碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌,KPC-2型碳青霉烯酶基因位于质粒上,可以通过质粒进行快速的转移传播,应重点监测。PFGE结果显示我院病房存在交叉感染现象。接合子的耐药性较原始的临床株耐药性降低,说明临床株对碳青霉烯酶药物的耐药机制同时存在多种。


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