模拟失重状态下大鼠抗肺炎链球菌感染能力的变化

【摘要】：目的： 失重会对机体呼吸系统产生影响，并可导致一定程度肺组织损伤。本实验采用大鼠尾悬吊模拟失重状态的方法，观察模拟航天失重状态下，呼吸道感染肺炎链球菌后抗感染能力的变化，深入了解感染肺炎链球菌后大鼠肺组织的病理改变，血液系统中炎症指标的改变，细胞免疫CD4+/CD8+的改变等，为失重所致肺损伤的药物防护提供理论依据，为航天医疗保障提供依据。 方法： 1模拟失重状态下大鼠肺部感染模型的建立健康清洁级雄性Wistar大鼠32只，体重290±20g，按照随机数字表法分为4组，A组：悬吊且感染肺炎链球菌组（尾悬吊3天后经气管注入肺炎链球菌），B组：悬吊不感染肺炎链球菌组，C组：不悬吊感染肺炎链球菌组（和尾悬吊组同一时间感染肺炎链球菌）和D组：不悬吊不感染肺炎链球菌组，每组8只，采用尾悬吊法模拟失重状态，具体为每只鼠笼内悬吊1只大鼠，尾部悬于笼顶，使鼠前肢踏于笼底，后肢悬空，身体纵轴与水平面约30°。实验环境为室温（22℃），昼夜周期12h:12h，大鼠可以自由进食、饮水。肺炎链球菌感染组于悬吊第4天开始采用气管插管法经气管注入0.4ml9×108CFU/ml的美国菌种保藏中心保存的标准菌株(ATCC6303)，大鼠共悬吊7天，第8天取材，实验结束，未注菌组与注菌组同一时间经气管插管注入同等量(0.4ml)的无菌生理盐水做为对照，均注入1次。 2肺炎链球菌的复苏及菌悬液的配制ATCC6303，购自上海市米宝莱科技有限公司。按照说明书将细菌复苏后再转血培养瓶中增菌保存。增菌培养后的细菌用无菌注射器吸取1ml放入离心管中，12000r/min，高速离心5min后，弃去上清液，将白色细菌沉淀用无菌生理盐水配成混悬液，用简易细菌浓度测定仪配制所需浓度待用。 3血常规、C反应蛋白(CRP)及全血标本处理大鼠用2%戊巴比妥钠按60mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后经颈动脉插管或腹主动脉取血，7小时内进行血常规和CRP的测定，用CD3/CD4/CD8抗体标记制备流式细胞仪检测液。全血标本的处理方法为：取抗凝全血50μl放入5个专用的试管内:空白对照管、CD3抗体（CD3-Alexa Fluor647）、CD4抗体(CD4-FITC)、CD8抗体(CD8-PE)标记管及3种抗体混合标记管。除空白对照管外，各试管内加抗体1μl混匀，37℃水浴30min后加2ml溶血素，混匀后再次水浴10min，1200r/min，离心5min后弃去上清液，加PBS2ml，如前操作再洗1次，弃去上清，加PBS500μl上机检测。 4肺组织病理学检查取右肺上叶组织，4%多聚甲醛固定，切片做HE染色，用光学显微镜观察。 结果： 1.大鼠肺脏改变： A组可见较严重的肺淤血和小静脉、毛细血管充盈扩张，肺泡融合，肺泡间隔增厚及肺泡腔受压变形，肺泡腔内红细胞渗出。B、C组也可见部分上述改变，但炎症反应程度较轻； 2.注菌组大鼠(A、C组)均从肺组织和肺泡灌洗液中培养出肺炎链球菌,在血琼脂平板上的生长结果如下图(11、12)所示，可见A组较C组细菌生长繁殖旺盛，B、D组未注菌，无细菌生长。 3. A、B、C组较D组中性粒细胞百分比升高，C反应蛋白值明显增高；淋巴细胞绝对数减少，淋巴细胞百分比下降，以A组最为明显。 4. CD4+/CD8+比值悬吊组较对照组低，但经分析差异无统计学意义；4组间实验前后体重变化结果显示A组体重减轻最明显。结论：失重状态下大鼠机体免疫功能降低，抗肺炎链球菌感染能力降低，肺部感染的病理表现更加严重，炎症反应更强，体重减轻更明显，需要给予相应的保障措施。