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黄芪甲苷对肾小球系膜细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制研究

曹玲玲  
【摘要】:目的:研究黄芪甲苷对H_2O_2诱导肾小球系膜细胞氧化应激损伤的保护作用,并进一步探讨其分子机制。 方法: 1.建立肾小球系膜细胞氧化应激损伤模型 将培养的人肾小球系膜细胞(HMC)随机分为6组:正常对照组、H_2O_2(1×10~5、2×10~5、3×10~5、4×10~5、5×10~5nmol L~(-1))损伤组,H_2O_2刺激4h,MTT法检测细胞活力,测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性。 2.黄芪甲苷对肾小球系膜细胞氧化应激损伤的保护作用 将培养的人肾小球系膜细胞随机分组:①正常对照组;②H_2O_2模型组;③黄芪甲苷干预组:黄芪甲苷6.25、12.5、25、50、100nmol L~(-1)预处理24h;④阳性药对照组包括:分别加入抗氧化剂Tempol(1×10~5nmol L~(-1))和人参皂苷Rg1(3×104nmol L~(-1))预先处理24h。各细胞组处理后,采用MTT法观察细胞活力;检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、超氧化物岐化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。 3.黄芪甲苷对肾小球系膜细胞氧化应激损伤保护作用的机制 将培养的人肾小球系膜细胞随机分组:①正常对照组;②H_2O_2模型组;③黄芪甲苷干预组:黄芪甲苷12.5、100nmol L~(-1)预处理24h;④阳性药对照组:抗氧化剂Tempol(1×10~5nmol L~(-1))预先处理24h。各细胞组处理后,采用Hoechst33258染色检测细胞凋亡;DHE荧光染色检测胞内活性氧的产生;流式细胞术检测细胞周期变化情况;Western blot方法测定细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin A及磷酸化p38、T-p38的表达。 结果: 1.建立肾小球系膜细胞氧化应激损伤模型 检测结果显示:1×10~5、2×10~5、3×10~5、4×10~5、5×10~5nmol L~(-1)H_2O_2均能诱导肾小球系膜细胞发生氧化应激损伤,细胞存活率明显降低,细胞活力与H_2O_2浓度及其作用的时间呈正相关下降趋势;细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性升高,且随着H_2O_2浓度的增加,培养液中LDH活性有升高的趋势。 2.黄芪甲苷对肾小球系膜细胞氧化应激损伤的保护作用 黄芪甲苷及阳性药组均能够减轻H_2O_2(3×10~5nmol·L~(-1))诱导的肾小球系膜细胞氧化应激损伤。实验结果显示:与模型组比较,用药组细胞存活率及细胞活力明显升高,细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性下降、超氧化物岐化酶(SOD)活性升高,丙二醛(MDA)含量降低。 3.黄芪甲苷对肾小球系膜细胞氧化应激损伤保护作用的机制 结果显示:100nmol·L~(-1)黄芪甲苷能够显著减轻H_2O_2(3×10~5nmol·L~(-1))诱导的肾小球系膜细胞氧化应激损伤;抑制细胞凋亡,降低胞内ROS产量;调节细胞周期蛋白Cyclin D1表达、各细胞周期的百分比及细胞正常增值;降低磷酸化P38的表达等有关。 结论: 1. H_2O_2体外诱导肾小球系膜细胞氧化损伤模型的建立最佳条件:3×10~5nmol L~(-1)H_2O_2作用4小时。 2.黄芪甲苷可对抗H_2O_2诱导的细胞损伤,提高细胞活力,降低LDH的活性,增加SOD活性、降低脂质过氧化物MDA含量。 3.黄芪甲苷对H_2O_2诱导肾小球系膜细胞氧化应激损伤保护作用的机制与降低细胞内ROS,上调细胞周期蛋白Cyclin D1的表达、抑制p38/MAPK信号通路,抑制细胞凋亡有关。


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