采用噬菌体肽库筛选Rh（D）血型抗原模拟表位及其鉴定

【摘要】：目的用人源纯化的混合抗Rh（D）多克隆抗体筛选噬菌体肽库，从中寻找到Rh（D）血型抗原的模拟表位，为研制针对Rh（D）血型不合新生儿溶血病（RhD-Hemolyticdisease of newborn, RhD-HDN）的新型诊断抗原、制备特异疫苗以及探索新的治疗方法提供实验基础。 方法1.收集5例经不规则抗体筛查为阳性并鉴定含抗Rh（D）抗体的Rh（D）阴性者血清，经等比例混合后，分别用RhD（-）A型、RhD（-）B型压积红细胞对血清中的抗A、抗B抗体于4℃过夜吸收处理；渗透浓度为30mmol/L的PB作为裂解液,将遗传表现型为CCDee的RhD阳性O型红细胞制备成血影细胞,观察其抗原性；以血影细胞作为抗原，吸附血清中抗Rh（D）抗体，再用低pH值缓冲液洗脱、分离纯化抗Rh（D）抗体，用DEAE-Sephadex A-50层析法提取其中免疫球蛋白G（Immunoglobulin G, IgG）组分；用western blot鉴定条带成分，微柱法测抗Rh（D）抗体效价。 2.用纯化的多克隆抗Rh（D）抗体对噬菌体随机十二肽库进行三轮吸附-洗脱-扩增过程筛选，计算每轮的富集率；酶联免疫吸附（Enzyme Linked ImmunosorbentAssay, ELISA）法检测每轮筛选后洗脱物与抗Rh（D）抗体的结合情况；ELISA法检测随机挑取的第三轮筛选后滴度测定平板上的26个噬菌体克隆与抗Rh（D）抗体结合情况；对ELISA法检测中A450值高于0.5的16个噬菌体克隆进行阳性噬菌体克隆的初筛实验，逐一检测每个噬菌体克隆与抗体的结合力；提取阳性克隆DNA并进行测序，推导外源多肽的氨基酸序列。凝集抑制实验检测噬菌体展示的多肽对Rh（D）血型抗原结合的模拟作用。 结果 1.5例血清中均含抗Rh（D）抗体，微柱法检测混合血清抗Rh（D）抗体效价为32；混合血清中的抗A和抗B血型抗体被完全吸收，吸收后血清中的抗A和抗B效价均＜2；制备的血影细胞保持了较强的抗原性；纯化后抗Rh（D）抗体IgG组分效价达到32。 2.三轮筛选后，富集率从（4.45×10-6）%增加到（4.27×10-5）%；随着筛选轮数增加，噬菌体洗脱物与抗Rh（D）抗体的结合力逐渐增强；第三轮筛选后26个噬菌体克隆与抗Rh（D）抗体具有不同的结合力，其中2,8,12,17,21,22克隆与抗Rh（D）抗体呈高亲和力结合；初筛实验中洗脱的噬菌体滴度测定显示克隆2,8,12,17,21,22在与抗体结合后的洗脱物中含量较高，并且与牛血清白蛋白（BSA）反应结合后的洗脱物中含量很低；上述6个阳性克隆中4个噬菌体克隆DNA序列一致：5-CCGAGCCAGGGGTACGTGATACTGCTGGACGAGAAG-3，展示相同的氨基酸序列（PSQGYVILLDEK），命名为C2；另外2个噬菌体克隆DNA序列一致：5'-ACAATGTTAAATCGTGCTCATGATTTTTCTGAATGT-3'，展示相同的氨基酸序列（TMLNRAHDFSEC），命名为C21。凝集抑制实验结果表明展示这两个多肽的噬菌体可以抑制Rh（D）抗原阳性红细胞的凝集作用。 结论 1.本实验纯化了抗Rh（D）多克隆抗体，并获得了高效价的抗Rh（D）抗体的IgG组分，为下一步利用噬菌体肽库获得Rh（D）血型抗原模拟表位研究奠定基础。 2.多肽PSQGYVILLDEK和TMLNRAHDFSEC可以模拟Rh（D）血型抗原表位，具有建立针对RhD-HDN的新型诊断抗原和制备特异疫苗的潜能。