microRNA-203通过APC介导活化Wnt/β-catenin信号通路在佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞中的调控作用及机制研究

【摘要】：风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种病因不明的以滑膜增生、炎症反应、软骨降解以及骨破坏为特征的慢性、进行性、系统性、炎症性关节病。众所周知,成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)的异常活化在滑膜炎症和关节破坏的起始阶段以及进行性发展阶段都起到重要作用。文献报道显示在RA FLS中Wnt/β-catenin信号通路的异常活化在一定程度上参与控制FLS的活化从而导致RA的发生。Wnt信号通路的活化在多种不同层面受到许多各种不同的在生物学进化上相对保守的效应蛋白的调控。腺瘤性结肠息肉病基因(adenomatous polyposis coli,APC)参与组成的蛋白降解复合物用于控制细胞质内游离的Wnt信号通路的转录辅激活物β-catenin蛋白的量,因突变或者其他包括DNA甲基化和micro RNAs等在内的表观遗传学修饰的原因使得APC的表达异常的情况在多种人类疾病中被检测到。Micro RNAs(mi RNA)是一类19-23核苷酸长度的短的内生的单链非编码RNA通过在转录后水平调控基因的表达参与调控包括细胞周期、细胞分化、增殖、凋亡等在内的多种生物学过程。近几年已经在RA的外周血单核细胞、成纤维样滑膜细胞中发现多种异常表达的mi RNA,但是参与调控此过程的具体机制以及异常表达的mi RNA通过何种机制参与调控RA的发生发展目前还不明确。因佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)病理特征与RA相似,本研究选择AA模型作为动物研究对象,FLS作为细胞研究对象,目的在于探讨异常表达的mi RNA-203与wnt信号通路的负调控因子APC之间的关系以及mi RNA-203与APC表达异常在RA中的作用及其可能的机制。主要研究内容概括如下:1.AA大鼠FLS中Wnt/β-catenin信号通路的变化通过左后足趾皮内注射完全弗氏佐剂造AA大鼠模型。Western blot结果显示与正常组相比在来源于AA大鼠滑膜的FLS中存在Wnt/β-catenin信号通路的异常活化,β-catenin、c-myc和cyclin D1的蛋白表达增加,内源性负调控蛋白APC的蛋白表达降低。2.APC在FLS活化过程中的作用为了阐明APC在FLS活化过程中的作用,通过在来源于正常大鼠滑膜的FLS中转染特异性靶向大鼠APC的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)降低APC的表达,结果显示下调APC能够促进FLS增殖,Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白β-catenin的m RNA水平无明显改变而蛋白表达水平明显增加并且Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因c-myc和cyclin D1的m RNA和蛋白水平均明显升高,提示下调APC的表达可能通过减少β-catenin的降解而活化Wnt/β-catenin信号通路进而在FLS的活化过程中发挥调控作用。3.miRNA-203与APC的靶向关系预测应用生物信息学软件预测miR-203潜在的作用靶点,结果显示Wnt/β-catenin信号通路的内源性负调控基因APC的m RNA的3’非编码区上存在mi R-203的结合位点,同时Q-PCR结果显示mi R-203在AA大鼠的FLS中的表达明显高于正常组,提示在AA FLS中异常高表达的mi R-203可能通过靶向调控APC的表达进而调控Wnt/β-catenin信号通路的活化,参与调控AA的发生发展。4.miRNA-203在FLS活化过程中的作用为了阐明在AA大鼠FLS中异常高表达的miR-203对FLS的活化以及风湿性关节炎的发病机制中的作用并验证mi R-203与APC之间的靶向关系,本实验首先在正常组的FLS中转染特异性的mi R-203 mimics上调mi R-203的表达,MTT结果显示过表达mi R-203能够明显促进FLS的增殖,上调mi R-203的表达亦能明显抑制APC蛋白的表达,APC蛋白的表达减少导致β-catenin蛋白降解减少,β-catenin的蛋白表达水平增加,同时Wnt/β-catenin信号通路的下游转录因子活化,c-myc和cyclin D1的m RNA和蛋白表达水平增加,在AA组FLS中转染mi R-203 inhibitor减少mi R-203的表达也能通过增加APC的表达从而抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化。然而,当在AA组FLS中转染靶向大鼠APC基因的si RNA后再给予细胞mi R-203 inhibitor处理并不能抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化,进一步验证了异常表达的mi R-203可能是通过靶向APC来调控Wnt/β-catenin信号通路的活化进而参与调控AA的发生发展。综上所述,本研究结果表明在AA FLS中表达减少的APC可能通过抑制泛素依赖的β-catenin的降解,进而活化Wnt/β-catenin信号通路参与调控FLS的异常活化过程,此外,研究还发现APC的表达减少可能与AA FLS中mi R-203异常高表达有关,提示APC和mi R-203可能作为潜在的RA治疗的靶点,这将为RA的诊断和治疗提供新的思路。