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OPG和RANKL基因多态性、蛋白水平的表达在类风湿关节炎患者疾病活动性骨与关节损伤中的意义

徐胜前  
【摘要】:研究背景核因子κB活化因子受体配体(Receptor or Activator of NF-KB Ligand,RANKL)/核因子κB活化因子受体(Receptor or Activator of NF-KB,RANK)/护骨素(Osteoprotegerin,OPG)系统是一个已经被证实与骨代谢和骨损伤密切相关的系统,而且作为肿瘤坏死基因家族的成员,该系统又与免疫系统之间有着密切的联系,由此产生的新的学科分支--骨免疫学是近年来热门的研究话题。研究显示,该系统的基因单核苷酸多态性(Single-nuclear polymorphism,SNP)与骨质疏松症(Osteoporosis,OP)、某些自身免疫病的易感性及其骨代谢和骨损伤相关。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性滑膜炎为主要病理特点、以骨与关节损伤为主要危害的慢性、炎症性、全身性自身免疫性疾病,其骨与关节的损伤主要表现为局部的骨侵蚀/破坏和全身的骨丢失(以OP为主要表现),随着病变的反复发作、持续发展,最终可导致骨与关节的畸形、功能障碍和致残等,阻止骨与关节损伤的发生和发展是RA临床治疗的关键,因此探索RA患者骨与关节损伤发生的机制、探讨新的抑制其骨与关节损伤发生的治疗途径是研究的难点和重点。目的检测OPG基因(TNFRSF11B)1181GC(rs2073618)位点、163AG(rs3102735)位点和RANKL基因(TNFRSF11)401AG(rs2277438)位点SNP、同时测定其各基因型患者上述基因表达产物——外周血清中OPG和可溶性RANKL(soluble RANKL,s RANKL)水平的变化,分析OPG和RANKL基因的SNP及其蛋白表达水平对RA患者疾病易感性、疾病活动性、骨与关节损伤——局部骨侵蚀(以双手Sharp评分表示)和全身骨丢失(以骨密度-Bone mineral density,BMD表示)变化的影响,探讨RANKL/RANK/OPG系统在RA中的意义。方法选择200例RA患者和201例相匹配的健康对照组,采用连接酶检测反应(LDR)-PCR方法检测OPG基因rs2073618、rs3102735位点和RANKL基因rs2277438位点SNP;同时采用ELISA法测定RA患者外周血中OPG和s RANKL的水平;采用DEXA法测定其中113例RA患者和120例正常对照组股骨和腰椎部位BMD;同时详细记录RA患者疾病活动性指标,包括关节肿胀数、关节肿胀指数、关节压痛数、关节压痛指数、VAS评分、晨僵时间、日常生活能力(HAQ)、血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽抗体(anti-CCP),计算疾病活动性积分(disease activity score 28,DAS28);摄双手X线平片,根据Sharp评分标准进行双手X线Sharp评分。比较其等位基因分布频率、基因型频率及单倍体型在RA组及对照组中的分布,分析上述基因SNP对RA患者外周血中OPG和s RANKL水平的影响,并比较不同基因型RA患者中外周血OPG和s RANKL水平、各部位BMD、Sharp评分及各项疾病活动性指标间的差别。结果1.OPG基因rs2073618位点、rs3102735位点和RANKL基因rs2277438位点各等位基因及基因型分布频率在RA组与对照组中均无明显差别(P0.05)。2.OPG和RANKL基因单倍体型(rs2073618G-rs2277438G-rs3102735G)携带者RA疾病易感性明显降低(1.5%vs 6.0%)(OR:0.216,95%CI:0.081-0.575,P=0.0008),OPG和RANKL基因单倍体型(rs2073618G-rs2277438A-rs3102735G)携带者RA易感性明显增加(14.5%vs 8.4%)(OR:1.862,95%CI:1.179-2.943,P=0.007)。3.RA患者外周血s RANKL水平[79.69(43.59)vs 70.13(30.61),z=2.368,P=0.018]、和s RANKL/OPG比值[0.41(0.20)vs 0.27(0.26),z=5.259,P0.0001]均较正常组明显升高,RA患者外周血OPG水平[202.86(123.44)vs 285.14(318.61),z=4.029,P0.0001]较正常组明显降低。4.RA患者中OP的发生率为31.9%(36/113),明显高于对照组13.3%(16/120)(x2=11.520,P=0.001)。RA组中伴OP的患者的年龄(59.03±12.67 vs 51.75±11.62,t=3.021,P=0.003)、关节肿胀数[10.5(7)vs 7(6),z=2.138,P=0.032]、双手X线关节间隙狭窄评分[54.5(65)vs 11.5(30),z=3.210,P=0.001]、双手X线骨侵蚀评分[47(82)vs 10(31),z=3.263,P=0.001]和双手X线Sharp评分[103(146.5)vs 22(62.75),z=3.355,P=0.001]明显高于无OP的RA组,而其他临床及实验室指标(包括外周血s RANKL和OPG水平)在两组间无明显差别(P0.05)。5.RANKL基因rs2277438位点表达为纯合型(AA或GG型)的RA患者(n=62)在L3(1.05±0.22 vs 0.93±0.26,t=2.314,P=0.023)、L4(1.06±0.24 vs 0.94±0.28,t=2.207,P=0.030)、L2-4(1.04±0.21 vs 0.89±0.28,t=2.788,P=0.007)部位BMD均明显高于杂合型(AG型)RA患者(n=39),双手X线Sharp评分[15.50(46.75)vs 43.00(108.75),z=2.419,P=0.016]和外周血s RANKL水平[66.18(29.05)vs 84.51(73.09),z=2.491,P=0.013]则明显低于表达为杂合型(AG型)的RA患者;OPG基因rs2073618和rs3102735位点不同基因型RA患者间BMD、双手X线Sharp评分和外周血OPG水平比较,差别无统计学意义(P0.05)。6.OPG基因rs2073618位点表达为纯合型(CC或GG型)的RA患者(60例)在下列疾病活动性指标上明显高于表达为杂合型(CG型)的RA患者(40例):关节压痛数(12.69±6.36 vs 9.04±5.22,t=2.352,P=0.022)、关节压痛指数(17.19±8.09 vs11.88±6.32,t=2.732,P=0.008)、晨僵时间[30(180)vs 5(30),z=2.161,P=0.031]、VAS评分[6(2)vs 4(2),z=2.962,P=0.003]和DAS28(6.20±0.97 vs 5.30±1.61,t=2.388,P=0.023)。RANKL基因rs2277438位点、OPG基因rs3102735位点不同基因型RA患者间各疾病活动性指标无差别(P0.05)。7.相关性分析显示:RA患者外周血s RANKL水平与OPG水平呈正直线相关(r=0.568,P0.0001);RA患者各部位BMD均与年龄呈显著负直线相关(P0.0001),RA患者各部位BMD(总的腰椎2-4部位BMD除外)均与双手X线Sharp评分呈负直线相关(P0.05-0.0001);腰椎2-4部位BMD与外周血s RANKL/OPG比值呈负直线相关(r=-0.285,P=0.003);股骨Neck区、Ward区、G.T.区和总股骨区BMD与RA病程和关节肿胀数呈负直线相关(P0.05-0.001),L2、L3和L4部位BMD与CRP呈负直线相关(P0.05-0.001)。RA患者外周血s RANKL水平、OPG水平和外周血s RANKL/OPG比值与RA患者各疾病活动性指标间均无相关性(P0.05)。8.采用多元Linear Regression分析,以年龄、病程、外周血s RANKL/OPG比值、RF、DAS28、抗CCP抗体为自变量,以Sharp评分为应变量,结果显示:RA患者Sharp评分与病程(β=0.725,t=9.078,P0.0001)、外周血s RANKL/OPG比值(β=0.166,t=2.104,P=0.039)、年龄(β=-0.179,t=2.274,P=0.026)呈直线相关(R2=0.570,F=33.137,P0.0001)。以DAS28为应变量,多元线性回归未发现外周血s RANKL、OPG水平及外周血s RANKL/OPG比值与RA患者的疾病活动性有关。9.以年龄、性别、BMI、病程、是否使用糖皮质激素、DAS28、Sharp评分为自变量,以总的股骨或腰椎是否发生OP(0=无OP,1=OP)为应变量,采用二项分类的多元回归分析Logistic Regression(Backward LR法)分析上述自变量的变化对RA患者OP发生的影响,结果发现:年龄(OR=1.058,P=0.014,95%CI:1.012-1.106)和Sharp评分(OR=1.021,P=0.001,95%CI:1.008-1.033)为RA患者发生OP的危险因素(R2=0.262,x2=17.692,P=0.001)。增加OPG基因rs2073618位点基因型(1=CC或GG,2=CG)、OPG基因rs3102735位点基因型(1=AA或GG,2=AG)和RANKL基因rs2277438位点基因型(1=AA或GG型,2=AG型)为自变量后,再次采用二项分类的Logistic Regression(Backward LR法)分析,结果发现:RANKL基因rs2277438位点基因型(1=AA或GG型,2=AG型)为RA患者发生OP的独立危险因素(OR=2.932,P=0.048,95%CI:1.008-8.529)。结论1.OPG基因rs2073618、rs3102735位点和RANKL基因rs2277438位点SNP与安徽籍汉族RA患者的易感性无关;但OPG和RANKL基因单倍体型(rs2073618Grs2277438G-rs3102735G)为RA的保护性因素,而单倍体型(rs2073618Grs2277438A-rs3102735G)是危险因素。2.RANKL/OPG基因SNP对RA的影响各司其职;RANKL基因rs2277438位点SNP与RA患者的外周血s RANKL水平升高有关,并与RA患者局部骨侵蚀和椎体OP的发生相关。OPG基因rs2073618位点SNP与RA患者疾病活动性相关。3.作为RA骨与关节损伤的两大表现形式:全身骨丢失与局部骨侵蚀是密切相关的,RANKL/OPG系统是联系它们的纽带。


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