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基于质谱的糖蛋白糖链结构解析策略研究

张曼丽  
【摘要】:蛋白质糖基化修饰在生理病理过程中起着重要作用,但糖蛋白质糖链结构分析方法仍在发展中,糖蛋白质组学的方法研究成为研究重点。在病理发生发展过程中,位点特异性糖链结构的变化显著。而传统的PNGase F切糖与相应的修饰位点与糖链结构鉴定技术,无法将糖肽的糖基化位点,与相应的糖链联系在一起,所以,位点特异性糖链结构解析成为当前糖蛋白质组研究的重要目标。本论文有三章构成,第一章,首先介绍糖蛋白质组学的研究现状,糖基化位点及糖链结构解析的重要性;其次对糖基化位点、糖链结构获取方法及完整糖肽结构解析的常用策略进行概述。第二章,介绍了基于固定化Pronase E酶切,解析位点特异糖链结构方法的建立。文中对Pronase E溶液酶切的蛋白与酶的用量比,酶切时间,Pronase E固定化酶的材料选择,及固定化酶的有效贮存时间进行监测,并比较优化了亲水相互作用色谱和多孔石墨化炭黑两种富集方法、α-氰基-4-羟基肉桂酸和2,5-二羟基苯甲酸两种基质,对于糖链结构鉴定的选择性。另外,对比了MALDI-TOF仪器和高精度Q-Exactive仪器,对于检测糖链结构或完整糖蛋白方面的差异性。最后选择Pronase E溶液酶切,蛋白比酶1:1以上,酶切时间为48 h;Pronase E固定化酶的材料选用CNBr Beads,酶与材料质量比1:10的比例,进行固定化酶的合成,结合效率为40%,酶切时间为24 h。选择多孔石墨化炭黑富集,Pronase E所得糖链使用DHB为基质,PNGase F所得糖链选用DHB+1 mM Na Cl为基质进行MALDI-TOF检测。第三章,建立完整糖肽的分析策略,实现对血清高丰度糖蛋白的完整糖肽的定性定量分析。以IgG为标准糖蛋白,经过Trypsin酶切及HILIC富集,获得完整糖肽,在此基础上,经过PNGase F酶切,获得糖基化位点信息,结合完整糖肽的检测信息,借助Byonic(Proteomics Discover 2.0)和Maxquant两个软件,并将两个软件得到的数据整合,获取完整糖肽的糖基化位点及糖型信息,通过位点特异性糖肽的峰面积,以实现完整糖肽定量分析。并将此方法应用于人血清11种高丰度糖蛋白的完整糖肽的分析,实现对肺癌血清样本的完整糖肽的定性定量鉴定。为获取肺癌的高丰度蛋白质糖肽组成特征,寻求可能的诊断标志物提供了方法策略。


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