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参附配伍对心肌细胞减毒作用的机制研究

赵佳伟  
【摘要】:中药复方是中医用药的主要形式,药物通过配伍组合,组分间相互作用,产生单一药物无法达到的疗效。但正因为成分的复杂多样,导致中药复方治疗疾病的靶点多样,作用机制不明确,成为中药复方走向世界的阻力之一。本课题主要以参附方为对象进行研究,探索附子毒性作用的途径和机制,研究参附配伍组分减毒作用的机制。本文首先以附子水提取液6.25,12.5,25,50,100 g·L-1作用于H9c2细胞24h,荧光染色和CCK-8法检测细胞存活率;附子水提取液6.25,12.5,25 g·L-1作用于H9c2细胞24h,流式细胞仪检测线粒体膜电位、活性氧(ROS)生成量的变化;使用相应的荧光探针,结合激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内Ca2+、线粒体内Ca2+以及线粒体内超氧化物的变化;检测细胞内ATP浓度变化;实时荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖活化受体共激活因子-1α(Pgc-1α),Bcl-2和Bax mRNA的表达;Western蛋白印迹法检测Pgc-1α蛋白的表达;Western blot检测PGC-1α蛋白的表达。发现附子水提取液12.5~100 g·L-1作用于H9c2细胞,可以显著抑制细胞活性(P0.05),IC50值为47.4669g·L-1,95%的可信限32.5997~69.1145 g·L-1。附子水提取液25 g·L-1处理后ROS的荧光强度由空白对照组的203.7±66.8升高到453.5±78.3(P0.05),线粒体超氧化物的荧光强度由5.35±1.77升高到26.82±8.52(P0.01),线粒体膜电位由1.72±0.46下降到0.836±0.39(P0.05),线粒体内Ca2+的荧光强度由37.96±4.31下降到9.24±1.65(P0.01),细胞内Ca2+的荧光强度由7.82±0.79升高到22.07±0.51(P0.05),细胞内ATP浓度由(10.56±0.39)μmol·g-1蛋白下降到(5.27±1.06)μmol·g-1蛋白(P0.05)。实时荧光定量PCR和Western蛋白印迹检测结果显示,与空白对照组相比,附子水提取液25 g·L-ee1组Pgc-1αee和Bcl-2的mRNA相对表达量分别由空白对照组的1±0.10和1±0.10下降到0.086±0.062(P0.01)和0.429±0.059(P0.01),Bax的mRNA相对表达量由1±0.031升高到1.1725±0.06(P0.05);Pgc-1α蛋白的表达量由空白对照组的0.906±0.034下降到0.541±0.003(P0.01)。实验结果表明附子对心肌细胞具有一定的线粒体毒性,其作用是多种途径共同作用的结果。附子的心肌线粒体毒性可能是附子造成心肌毒性的原因。其次,通过考察乌头碱、人参皂苷Re及CaMKⅡ抑制剂KN-93对心肌细胞钙离子稳态的影响,对CaMKⅡ及相关钙调控蛋白基因和蛋白表达水平的影响,探索乌头碱致心律失常的机制以及人参皂苷Re的保护机制。各组先使用Fluo-4AM负载后进行药物处理,进行钙离子动态实时监测;药物处理后实时荧光定量PCR检测RyR2 mRNA的表达;Western blot检测CaMKⅡ、P-CaMKⅡRyR2及SERCA2蛋白的表达。发现乌头碱处理心肌细胞后能够引起心肌细胞钙瞬变的频率增加以及相对Ca2+含量升高,从而导致心肌细胞内钙紊乱,这种作用能够被维拉帕米(钙通道阻滞剂)及KN93(CaMKⅡ抑制剂)所抑制,说明乌头碱所引起的心率失常可能与CaMKⅡ有关。同时,人参皂苷Re能够降低乌头碱引起的钙瞬变频率增加,钙瞬变的幅度恢复正常。基因的结果表明乌头碱能够引起肌浆网上的钙通道RyR2mRNA转录水平的增加,蛋白水平的结果显示,乌头碱能够引起CaMKⅡ磷酸化水平和RyR2蛋白表达水平升高,这种现象能够被KN-93以及人参皂苷Re逆转。实验结果表明了乌头碱所引起的心率失常可能与增加了CaMKⅡ的磷酸化有关;同时,结果也表明了人参皂苷Re能够通过降低CaMKⅡ磷酸化对抗乌头碱引发的心律失常。本文首次揭示了附子的线粒体毒性;通过参附中有效成分之间的配伍来研究参附配伍减毒作用的机制,并发现了乌头碱致心律失常新的机制,以及人参中有效成分人参皂苷Re的保护作用。为参附配伍减毒作用以及中药配伍规律研究提供参考。


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