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miR-210促进小鼠BMMSCs血管内皮生长因子的表达和分泌

孙世林  
【摘要】:目的研究小分子非编码RNA mi R-210对小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)表达和分泌血管内皮生长因子(VEGF)的影响,为骨组织工程血管化研究提供实验数据。方法首先体外全骨髓液贴壁法培养小鼠BMMSCs,通过构建慢病毒载体Lenti-Lac Z和Lenti-mi R-210,分别转染小鼠BMMSCs和人脐静脉内皮细胞(HUVEC);MTT法检测慢病毒载体对小鼠BMMSCs增殖情况的影响;Lenti-mi R-210/BMMSCs和Lenti-Lac Z/BMMSCs于转染慢病毒载体后培养至第7d RT-PCR检测VEGF m RNA基因表达,第14d Western blot检测VEGF蛋白表达;通过PKH26红色荧光染料对Lenti-mi R-210/HUVEC和Lenti-Lac Z/HUVEC进行染色后,进行24h Matrigel成管实验,通过荧光显微镜观察成管效果,统计两组成管长度;构建Hy Stem-HP凝胶缓释系统,agomir-210和agomir-NC与BMMSCs复合Hy Stem-HP凝胶后行裸鼠皮下注射,7d后取标本进行10%中性福尔马林固定,脱水后包埋,石蜡切片行CD31免疫荧光染色,检测CD31阳性细胞含量。使使用SPSS13.0软件进行统计分析,实验数据以均数±标准差形式呈现,t检验和方差分析处理实验数据,检验水准取α=0.05。结果全骨髓液培养后5-7d,镜下见部分细胞呈梭形或多角形,散在分布;传代后贴壁细胞呈梭形旋涡状生长,细胞形态随传代培养逐渐一致;mi R-210慢病毒载体转染小鼠BMMSCs和HUVEC,当MOI=10时,转染效率最高,MTT法检测病毒对BMMSCs增殖无影响,Lenti-mi R-210和Lenti-Lac Z两组细胞培养第7dRT-PCR检测VEGF m RNA基因表达结果,mi R-210促进小鼠BMMSCs VEGF的表达(P0.01);第14d Western blot检测两组细胞VEGF蛋白表达,mi R-210组VEGF蛋白表达明显高于对照组,与RT-PCR结果一致;Matrigel成管实验24h结果Lenti-mi R-210组与Lenti-Lac Z相比,环形管状结构明显,端端接触多,管壁更完整;统计小管长度后比较两组小管长度,差异有统计学意义(P0.05);agomir-210和agomir-NC分别与BMMSCs复合Hy Stem-HP凝胶缓释系统裸鼠皮下注射7d后标本CD31免疫荧光染色结果统计分析显示agomir-210组CD31阳性细胞含量明显高于agomir-NC组,约是agomir-NC组的3倍。结论通过慢病毒载体,转染小鼠BMMSCs,过表达目的基因mi R-210后能够有效促进小鼠BMMSCs VEGF的表达和分泌,agomir-210 Hy Stem-HP凝胶裸鼠皮下实验表明,agomir-210促进BMMSCs微血管的形成。


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