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环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌方法的建立及其应用

曹科峰  
【摘要】:背景:铜绿假单胞菌作为自然界中常见的细菌,也是医院外科手术常见的感染病原体之一。临床现象表明铜绿假单胞菌在伤口感染时会形成绿色的脓液,从而诱发败血症、呼吸道感染以及尿路感染等。败血症主要发生于人体大面积烧伤以及心脏手术等,患者常伴有休克或者凝血等症状,患者皮肤上会出现坏死性脓包,通常会在患者的血管内有菌栓的形成;呼吸道感染最为常见的为借助机械呼吸而诱发的呼吸机相关性肺炎;截肢患者会因为置入导尿管而诱发尿路感染,长期使用抗生素治疗同样会诱发患者发生假单胞菌的感染。皮肤感染铜绿假单胞菌常见于机体受到损害而又潮湿的部位,例如婴儿的脐带周围、机体的烧伤部位以及潮湿的脚趾间等。在正常人体内发病率较低,当人体受到外界因素影响而导致抵抗力降低时,该菌可诱发严重的或者致死性的感染。目的:利用环介导等温扩增技术建立了铜绿假单胞菌的一种快速检测方法。方法:以铜绿假单胞菌gbca基因为模板,采用电脑在线引物设计的方法,来设计LAMP引物,利用反应体系的颜色变化及琼脂糖凝胶电泳的差异,检测分析铜绿假单菌,采用LAMP和PCR的方法同时检测不同菌株,考察LAMP方法的特异性和灵敏度。结果:本研究针对铜绿假单胞菌中的gbca基因设计LAMP序列,建立了铜绿假单胞菌的LAMP检测方法。与传统的PCR相比,LAMP不需要将DNA从样本中纯化出来,因此可以较为快速的应用临床样本的检测。但不可否认,LAMP技术也有一定的缺陷,例如相对于PCR而言,LAMP技术需要设计4条引物,其设计要求相对较高,同时,一旦有非特异性扩增的出现,会直观的反应在梯度条带上,误导样本的鉴别,而对于LAMP较为灵敏的特点,实验过程中较容易受到污染。为了更为直观的考察建立的LAMP方法对铜绿假单胞菌鉴定的适用情况,本研究还在反应体系中加入HNB染料,通过颜色变化来判定LAMP技术检测铜绿假单胞菌gbca基因,并对该方法的灵敏度以及特异性进行了考察。从实验结果能够看出:(1)颜色变化以及凝胶电泳的结果显示,只有铜绿假单胞菌的gbca基因在LAMP方法下发生了扩增反应,其他对照菌株没有发生LAMP扩增,说明该方法的特异性较好。(2)LAMP扩增结果显示与染料组凝胶电泳的结果一致,可以成功地检测在8.7 pg/ul浓度时铜绿假单胞菌的总DNA,而PCR法只能检测到浓度为87pg/ul的铜绿假单胞菌的总DNA,说明LAMP的检测灵敏度是PCR的10倍左右。同时采用LAMP和PCR检测临床收集的21份铜绿假单胞菌标本,其它10例对照菌也同样平行检测,结果表明LAMP和PCR的检出率是一致的(21/21),两种方法均未出现假阳性事件。结论:LAMP方法在检测铜绿假单胞菌时具有特异性强、灵敏度高等特点,适合于医疗卫生机构的推广。


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