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人卵巢颗粒细胞的体外培养与鉴定及白藜芦醇对其细胞生长影响的初步研究

李小双  
【摘要】:第一部分人卵巢壁层颗粒细胞分离、培养与鉴定研究目的探索稳定的人卵巢壁层颗粒细胞体外分离和培养的方法,为后续的体外研究奠定模型基础。研究方法密度梯度离心法分离卵泡液,获得壁层颗粒细胞(mural granulosa cells,mGCs)后,加入含血清培养基,置于37℃,5%CO_2培养箱中培养,倒置显微镜观察细胞形态与生长状况;采用HE染色、细胞免疫组化染色,检测卵泡刺激素受体(follicle estrogen receptor,FSHR)的表达,计算mGCs纯度;CCK-8法检测24h-120h OD值,并绘制生长曲线;显微镜下观察实验组(加自体卵泡液)与对照组(不加自体卵泡液)的细胞生长情况。研究结果(1)分离培养的颗粒细胞特异性表达卵泡刺激素受体(FSHR),阳性物质位于胞质中,阳性细胞90%以上;(2)颗粒细胞体外培养24h~72h为其对数生长期;(3)实验组(加自体卵泡液)的颗粒细胞生长状态优于对照组。结论分离培养的mGCs纯度较高,符合后续实验要求。第二部分白藜芦醇促进人卵泡颗粒细胞增殖活性并增加ATP生成研究目的探讨白藜芦醇对体外培养的人卵泡颗粒细胞的增殖及ATP生成的影响,为后续的体外实验奠定一定基础。研究方法制定纳入标准,选取符合条件的不孕症患者:青年组(38岁)、高龄组(≥38岁),于取卵日收集卵泡液分离颗粒细胞进行相关实验;透射电子显微镜观察m GCs及线粒体超微结构;化学发光仪检测ATP浓度。体外培养m GCs贴壁后,实验分为空白对照组、30μmol/L二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照组、(10、20、30)μmol/L白藜芦醇处理组。处理24、48 h,采用CCK-8法检测细胞增殖活性、增强型ATP检测试剂盒检测10μmol/L白藜芦醇处理组和空白对照组24 h后的ATP生成量。研究结果(1)高龄组中异型性、细长型、空泡状线粒体明显多于年轻组;(2)细胞内ATP水平,年轻组明显高于高龄组;(3)与对照组比较,(10、20、30)μmol/L白藜芦醇处理24 h均可增加m GCs增殖活性;(4)10μmol/L白藜芦醇处理细胞的ATP生成量较对照组明显增加。结论白藜芦醇可以促进人卵泡颗粒细胞的增殖活性及ATP的生成。


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