从CaN-NFAT3通路研究参附配伍减毒的作用机制

【摘要】：乌头类中药是我国临床常用中药,属于毛茛科植物。其中附子为植物的侧根。附子的主要功效为回阳救逆,补火助阳,散寒止痛。乌头碱作为附子中的主要成分,既是效应成分也是毒性成分。当乌头碱作为有效成分时具有强心、抗心律失常、抗休克、抗血栓、抑制中枢等作用;而当乌头碱作为毒性成分时可致心率变慢、传导阻滞、室性心动过速等症状。人参属五加科植物,具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺等功效。人参主要成分有人参皂苷A,人参皂苷Rg1,人参皂苷Re等。本实验室前期毒性实验研究中可知,附子中的主要成分乌头碱引起的心律失常可被人参拮抗,并且据文献报道,乌头碱与人参皂苷Re合用L型钙通道的抑制效果要比单独使用人参皂苷Re效果好。因此本文以附子主要成分乌头碱以及人参主要成分人参皂苷Re为研究对象开展进一步研究。文献已知,心肌细胞受到刺激后,细胞内钙离子升高,升高的钙离子可以与CAM结合,从而活化CaN与CAMKⅡ,活化后的CaN与CAMKⅡ分别可以使NFAT3与NF-kB转移入细胞核,发生心律失常。乌头碱尚可以促进钠离子内流,使细胞内钠离子浓度发生改变,通过Na~+/Ca~(2+)交换体使得细胞内钙离子发生改变,当心肌细胞内钙离子发生改变,CaN-NFAT3信号通路被激活。心肌细胞内持续升高的钙离子激活CaN,紧接着CaN活化NFAT3基因,NFAT3被活化后去磷酸化转移到细胞核內,与GATA4基因结合,诱导原癌基因c-fos等表达,继而胎儿基因ANP表达增加,导致心律失常最后发生心力衰竭。课题组前期工作表明乌头碱可以上调CAMKⅡ磷酸化水平,那么乌头碱是否可以引起诱导CaN激活,从而使NFAT3转移至核內,发生心律失常呢?因此本研究拟基于CaN-NFAT3信号通路开展参附配伍减毒机制探究。本文第一部分首先探讨了乌头碱是否通过心肌细胞兴奋-收缩偶联系统并且通过Na~+/Ca~(2+)交换体来调控钙离子,最后导致心律失常。采用激光扫描共聚焦显微镜,RT-PCR和Western blot等技术,用不同浓度(1μM,5μM,10μM)乌头碱刺激心肌细胞,研究乌头碱对心肌细胞内Ca~(2+)-ATP酶、Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP酶和Na~+-K~+-ATP酶的活性,Na~+、Ca~(2+)、K~+含量以及钙超载的影响;检测不同浓度乌头碱刺激心肌细胞后,钙离子瞬时变化;通过Na~+,Ca~(2+),K~+检测试剂盒和Ca~(2+)-ATP酶、Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP酶和Na~+-K~+-ATP酶检测试剂盒检测以上各指标的改变;继而观测SERCA2与RyR2的mRNA及蛋白的改变。结果表明:乌头碱刺激细胞后,与空白组比较,不同浓度乌头碱均可抑制钙瞬变浓度,高浓度乌头碱可以明显增加钙瞬变频率,以及增加钙离子浓度;细胞内Na~+,Ca~(2+)浓度上升,而K~+浓度降低,并且不同程度的降低了Ca~(2+)-ATP酶、Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP酶和Na~+-K~+-ATP酶活性;对SERCA2的m RNA与蛋白表达显著下调,对RyR2的mRNA与蛋白表达显著上调。以上均当乌头碱浓度较高时,结果具有显著的差异性。研究提示,乌头碱在高剂量时可以明显造成心肌细胞内离子紊乱,各ATP酶活性降低,转运各离子能力减弱,使得Na~+、Ca~(2+)浓度升高;同样明显地调节与钙离子通道相关的SERCA2a、RyR2的mRNA与蛋白质水平的表达,使得细胞内钙紊乱,出现钙瞬变现象。研究表明乌头碱可以通过Na~+/Ca~(2+)交换体,也可以通过心肌收缩偶联机制改变心肌细胞内钙离子,从而诱导离子信号通路的发生,引起多种心血管疾病,最终导致心力衰竭的发生。本文第二部分从离体和在体两个方面探究了乌头碱以及乌头碱与人参皂苷Re配伍使用后对CaN-NFAT3信号通路的影响。首先,在细胞水平上,乌头碱对心肌细胞进行刺激后,利用实时荧光定量PCR与Western blot技术检测ANP的mRNA以及蛋白水平表达,CaN、c-NFAT3、n-NFAT3蛋白水平表达。结果显示,ANP的mRNA表达水平上调,ANP蛋白表达水平增加;CaN蛋白表达水平升高,c-NFAT3蛋白表达水平下降,n-NFAT3蛋白表达水平升高,与空白对照组相比,当乌头碱为高浓度时,以上结果均具有显著差异性。使用乌头碱与人参皂苷Re配伍给药后,人参皂苷Re具有心肌保护作用,利用Western blot技术检测CaN、c-NFAT3、n-NFAT3、GATA4蛋白水平表达,结果显示,人参皂苷Re与乌头碱配伍后,与单独乌头碱给药组相比,CaN蛋白表达水平下降,c-NFAT3蛋白表达水平升高,n-NFAT3蛋白表达水平下降,细胞核內GATA4蛋白表达水平下降,并且结果具有显著差异性;为了进一步验证CaN-NFAT3信号通路与心律失常直接关系,使用FK506刺激心肌细胞,FK506为CaN抑制剂,利用Western blot技术检测ANP以及c-NFAT3、n-NFAT3蛋白表达水平,结果显示与乌头碱单独使用组相比,与FK506合用后可以明显降低ANP蛋白表达水平,c-NFAT3蛋白表达水平升高,n-NFAT3蛋白表达水平下降,结果具有差异性。该实验结果提示,人参皂苷Re对心肌细胞具有一定的保护作用,可以抑制由乌头碱引起的钙离子紊乱从而造成各蛋白水平的改变;当加入CaN抑制剂FK506之后,可以明显降低ANP蛋白表达水平,并且c-NFAT3蛋白表达水平升高,n-NFAT3蛋白表达水平下降,对下游通路没有造成影响,进一步证明乌头碱确实影响CaN-NFAT3信号通路。在动物水平上,人参附子三个比例(附子∶人参=2∶1,附子∶人参=1∶1,附子∶人参=1∶2)配伍煎煮,连续给小鼠灌胃14天,取心脏组织,提取组织蛋白后,利用Western blot技术检测ANP以及CaN、c-NFAT3、n-NFAT3、n-GATA4蛋白水平表达,结果显示,附子与人参配伍给药后,与附子单独给药组相比,可以抑制ANP、CaN蛋白表达,可以拮抗NFAT3蛋白转入细胞内,使胞浆内NFAT3蛋白增多,胞核内NFAT3蛋白降低,胞核内GATA4蛋白增多,当附子与人参配比为1:1时,以上结果具有显著性差异性。该实验结果提示,人参附子配伍比为1:1时,对心脏的保护作用最好,并且可以抑制附子单独使用时对心脏造成的毒性。本文探究了乌头碱对心肌细胞可造成钙离子紊乱,其通过影响钙稳态,钙调蛋白调控的CaN-NFAT3离子通路起作用;同时揭示人参皂苷Re可以通过抑制乌头碱造成的钙紊乱以及离子通路的改变发挥拮抗作用。动物水平上进一步证实人参与附子配伍可通过调控CaN-NFAT3离子通路而达到对心脏的保护作用。该研究为参附方配伍规律的系统研究提供佐证,也为参附方临床上预防治疗心律失常提供实验依据。