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高毒力肺炎克雷伯菌分子特征、碳青霉烯耐药机制及进化相关适应性代价研究

刘周  
【摘要】:目的:研究高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)临床分布、耐药现状及分子流行病学特征,分析碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌(CR-hvKP)的耐药机制及毒力特征,探讨CR-hvKP形成的主要进化途径及适应性代价产生规律。方法:(1)收集2015~2017年安徽地区34家医院每年9月份临床连续分离肺炎克雷伯菌2677株,剔除重复菌株及资料缺失株。应用质谱技术重新鉴定确证后,通过拉丝试验及毒力基因检测筛选出hvKP。应用琼脂倍比稀释法检测hvKP对常用抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC),WHONET5.6软件分析MIC数据并筛选出其中的CR-hvKP。应用多位点序列分型(MLST)及荚膜多糖分型分析hvKP的主要分子特征,通过eBURST软件分析各ST型hvKP之间的亲缘关系。(2)应用脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)技术分析CR-hvKP同源性,综合多重PCR及qRT-PCR技术检测CR-hvKP主要耐药机制,S1-PFGE联合Southern blot杂交技术分析CR-hvKP耐药质粒及毒力质粒携带情况,应用血清抗性及大蜡螟幼虫感染模型分析CR-hvKP毒力特征。(3)应用全基因组测序及BRIG/Snapgene等生物信息学软件分析,明确一株ST23~(K1)型hvKP(hvKP01)及一株ST11~(K47)型碳青霉耐药肺炎克雷伯菌(CRKP07)的染色体及质粒基因组特征。以上述菌株为亲代交叉导入各自质粒,构建两种携带双质粒系统CR-hvKP菌株,检测外源质粒携带稳定性。分析比较亲代与构建株生长曲线、对主要抗菌药物MIC值、荚膜多糖产量、生物膜形成量及毒力表型差异。应用共培养竞争性试验评估适应性代价程度。qRT-PCR检测比较亲代与构建株主要毒力因子及耐药基因表达水平差异。结果:(1)纳入本研究的肺炎克雷伯菌共计1494株,其中hvKP共计164株,检出率为11.0%。2015~2017连续3年的检出率分别为11.3%、10.0%及11.6%。感染患者以男性为主(61.6%),平均年龄60.3±17.6岁。患者主要临床科室为重症监护病房(21.3%)、呼吸内科(13.4%)及神经外科(6.7%)。HvKP主要分离自痰标本(66.1%)、脓液及分泌物标本(10.8%)及血液标本(6.5%)。全部hvKP共分为35种ST型和13种荚膜抗原分型,ST型以ST23(23.3%)、ST86(11.0%)及ST65(11.0%)为主,荚膜分型以K1(32.9)和K2(28.0%)为主,且ST型和荚膜型存在对应关系。(2)共检出12株CR-hvKP,其中以ST11~(K47)型为主(58.3%),3株ST11~(K47)型CR-hvKP存在同源性。CR-hvKP主要碳青霉烯耐药机制为产KPC-2(75.0%)及NDM-1(16.7%)型碳青霉烯酶,且全部碳青酶烯耐药基因均由质粒携带,质粒分子量大小28.8~78.2kb。10株(83.3%)CR-hvKP携带分子量大于200kb的高毒力质粒。CR-hvKP血清抗性水平及大蜡螟幼虫致死能力各异。(3)CRKP07携带分子量为43 334bp的pbla_(KPC-2)质粒,hvKP01携带分子量为225 890bp的pLVPK-like毒力质粒。成功构建变异株CRKP-pLVPK-like及hvKP-pbla_(KPC-2)。连续传代7天后,两株CR-hvKP对外源质粒携带率分别为76.7±5.51%及78.3±6.11%。与亲代相比,CRKP07-pLVPK-like获得高黏表型,生物膜形成能力、血清抗性及大蜡螟幼虫致死率上升,但对美罗培南MIC值下降,bla_(KPC-2)表达水平下降;hvKP01-pbla_(KPC-2)获得了稳定碳青霉酶烯耐药表型,但菌落高黏表型减弱、血清抗性及大蜡螟幼虫致死率下降,iucA及rmpA2表达水平下降。两株构建株竞争性常数均1,共培养竞争性生长曲线均呈现下降趋势。结论:(1)安徽地区hvKP检出率约为11.0%,以ST23~(K1)、ST86~(K2)及ST65~(K2)为主。虽然对临床常用抗菌药物耐药率不高,但已经出现CR-hvKP,分子特征以ST11型为主,且存在克隆传播趋势。(2)CR-hvKP主要耐药机制为产碳青霉烯酶。同时携带碳青霉烯耐药质粒及毒力质粒是其重要分子特征。(3)ST11型CRKP获得pLVPK-like质粒及ST23型hvKP获得pbla _(KPC-2)质粒均可进化为CR-hvKP,两种变异株均存在适应性代价。pLVPK-like质粒和pbla_(KPC-2)质粒存在相互拮抗关系。


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