下调PPP2R3A基因表达对肝癌细胞增殖和转移的影响

【摘要】：研究背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是成年人中最常见的原发性肝癌类型,预计2018年肝癌将是世界上第六大最常见的癌症,并且是全球癌症死亡的第四大原因[1],其发病机制尚不清楚,涉及多种遗传畸变的多步骤活动,导致肝细胞的恶性转化。目前主要的发病机制包括基因突变、遗传代谢改变、细胞内信号通路及局部肿瘤微环境等,而基因突变最为复杂,一些重要基因突变后,会引起一系列信号蛋白发生瀑布式改变,进而引发细胞的无限增殖、转移等行为改变。随着近些年来基因组测序技术的迅速开展,发现肝癌中一些常见的基因突变后能引发细胞不同生物学行为的改变。基因靶向治疗是近些年来治疗癌症的热点,同时更多的肿瘤标志物能有效地早期诊断疾病状况并监测治疗功效,因此找出关键的致病基因变得尤为重要。蛋白磷酸酶2A 的调节亚基 B"(Protein Phosphatase 2 Regulatory Subunit B"alpha,PPP2R3A)作为蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2 A,PP2A)调节亚基的编码基因,不只是参与PP2A结构的形成,磷酸酶活性的调节,底物的特异性以及亚细胞的定位等功能[2],还发现该基因能参与多种重要的肿瘤相关信号通路(Wnt、mTOR、ERK)的调节,并且影响细胞的增殖以及骨肿瘤细胞的迁移能力[3]。我们前期研究在肝细胞癌患者的肿瘤组织中检测出PPP2R3A基因出现变异,本研究初步观察了PPP2R3A基因在肝癌组织中表达情况。因此,我们进一步探索了PPP2R3A基因异常表达对肝癌细胞相关生物学行为的影响。研究目的探索下调PPP2R3A基因的表达对肝癌细胞生物学行为的影响研究方法利用免疫组织化学(immunohistochemical,IHC)特殊染色实验检测人肝癌组织中PPP2R3A基因的表达与定位情况,探索其与癌旁的表达强度差异;利用慢病毒载体介导的RNA干扰技术构建PPP2R3A稳定下调的肝癌细胞系,分别通过实时定量PCR(Quantitative Real-time,q-PCR)实验及Western blot实验,从mRNA水平和蛋白水平检测肝癌细胞内PPP2R3A基因的敲低效果;分别通过增殖、周期、迁移和侵袭实验,探索PPP2R3A基因敲低后对肝癌细胞的生物学行为的影响;并构建裸鼠移植瘤模型,探索PPP2R3A基因敲低对肝癌细胞生长的影响;通过蛋白电泳实验探索PPP2R3A基因影响肝癌细胞行为的可能机制,如P53信号蛋白。研究结果1、免疫组化实验中,发现在人肝癌组织中的PPP2R3A的表达主要定位于细胞质与细胞膜上,且癌组织中PPP2R3A的表达强度要高于癌旁组织;2、使用慢病毒载体成功构建稳定下调PPP2R3A基因的肝癌细胞系;3、稳定下调PPP2R3A基因抑制了肝癌细胞的增殖能力(P0.05),使肝癌细胞的G1/S期产生阻滞(P0.05),并且发现细胞内的P53蛋白表达增多;4、稳定下调肝癌细胞系PPP2R3A基因的表达后,其迁移与侵袭能力受到抑制(P0.01);5、通过持续观察移植瘤生长体积,发现稳定下调PPP2R3A基因后,动物体内的肝癌细胞生长受到抑制,体积较对照组明显减小(P0.01)。