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金诺芬、多黏菌素与伏立诺他联合对多重耐药革兰阴性菌抗菌活性的影响以及金诺芬耐药机制的研究

陈昊然  
【摘要】:目的1.探究金诺芬(Auranofin,ARF)与抗肿瘤药物伏立诺他(Vorinostat,SAHA)的药物联合在体外对革兰阴性菌的抗菌活性的影响。2.探究多黏菌素B(Polymyxin B,PMNB)与SAHA新型药物联合对多耐药革兰阴性菌在体外以及体内的抗菌活性的影响以及药物联合的抗菌作用机制。3.在金黄色葡萄球菌中诱导并筛选出金诺芬耐药(Auranofin-resistant,AR)菌株,寻找目标基因的突变位点。材料与方法1.通过对五株革兰阴性菌进行药敏试验,棋盘微量稀释法,来观察ARF和SAHA联合,其两者抗菌活性是否产生协同作用。2.选取四株革兰阴性菌株以及两株多耐药菌株进行药敏试验,棋盘微量稀释法,来观察PMNB和SAHA联合后,其两者抗菌活性是否产生协同作用。3.在体外通过时间-杀菌动力试验分别分析ARF和SHAH、PMNB和SAHA两种药物联合的抗菌活性。4.通过扫描电子显微镜观察,研究PMNB和SAHA药物联合对鲍曼不动杆菌细胞形态学的影响。5.通过使用流式细胞仪进行活性氧(Reactive oxygen species,ROS)分析以及添加ROS清除剂联合通过时间杀菌动力学研究,来探究PMNB与SAHA的联合产生抗菌活性的作用机制。6.通过大蜡螟模型,来初步验证PMNB与SAHA药物联合,在体内对革兰阴性菌的抗菌作用。7.在高浓度金诺芬环境下,诱导对金诺芬耐药的金黄色葡萄球菌RN450,通过分析药敏试验的结果,来判断最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)的改变情况。通过对耐药菌株多次传代后,观察耐药性是否稳定。8.通过提取细菌基因组DNA,设计目的基因的引物,聚合酶链式反应(Polymerase hain reaction,PCR)扩增目的基因,得到的PCR产物纯化,高通量测序,比对目标基因的核苷酸序列,寻找并明确出导致耐药性产生的突变位点。结果1.在ARF与SAHA联合治疗以及PMNB与SAHA联合中,对大肠埃希菌,鲍曼不动杆菌,肺炎克雷伯菌,铜绿假单胞菌均显示出了良好的协同作用。2.对于ARF和SAHA、PMNB和SAHA两组联合,在体外的时间-杀菌动力试验中与单一用药相比,均明显观察到抗菌活性的增加。3.PMNB单独治疗组破坏了细胞膜的稳定性和完整性,而SAHA单一治疗组对细胞形态并未发生改变。两者联合治疗组后,反而对细胞膜的完整性有一定的保护作用。4.PMNB和SAHA的药物联合明显增加了ROS的产生,加入ROS清除剂后,明显抑制了药物联合的抗菌活性。5.在大蜡螟模型中,PMNB和SAHA的药物联合明显增加了大蜡螟的生存率。6.筛选出五株金诺芬耐药的金黄色葡萄球菌RN450的MIC明显增加,并且在传代培养后,耐药性并未丢失,MIC结果保持一致。7.将测序结果与金诺芬耐药菌株的核苷酸序列进行比对后,发现在目标基因trxB内有两个不同的点突变。一个是第13个碱基的G变为T,另一个是第139个碱基的G变为A。结论1.ARF与SAHA联合后对革兰阴性菌展现出较好的抗菌活性,为继续研究两者的体内模型以及后期临床试验的准备做出理论性依据。2.PMNB与SAHA药物联合在体内,体外对MDR革兰阴性菌展现了良好的抗菌活性,为之后哺乳动物模型,临床试验,包括进入临床治疗选择范围做出重大的突出贡献。3.我们猜测PMNB与SAHA药物联合的抗菌机制,是通过PMNB破坏细胞膜,是细胞失去稳定性,帮助SAHA进入细胞内引起大量的ROS的产生,使细菌死亡。4.两个点突变,分别将位于第5个氨基酸的天冬氨酸改变为酪氨酸,第47个氨基酸的谷氨酸变为赖氨酸,导致负电荷的丢失。


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