收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

柯萨奇B3m病毒基因组全长cDNA文库的构建及阳性克隆的筛选

杨善志  
【摘要】: 目的:构建CVB_(3m)病毒株基因组全长cDNA基因表达文库,为进一步研究其体外 RNA转录产物的感染性,阐明致病机理及探索新型疫苗奠定基础。方法:制备 Balb/C新生乳鼠急性病毒性心肌炎模型并进行病理学检查;从感染CVB_(3m)的乳鼠 心肌组织中分离病毒,并在Hep2细胞中增毒;提取病毒mRNA、检测其纯度和浓 度;在AMV逆转录酶作用下,将病毒mRNA逆转录成第一链cDNA,在RNase H 和DNA聚合酶Ⅰ作用下合成第二链cDNA;将双链cDNA平头末端连接上EcoRⅠ 连接子,重组进噬菌体λgt11载体的EcoRⅠ酶切位点之间,用噬菌体包装蛋白包 装,转染宿主菌Y1090;经IPTG诱导和X-gal颜色选择测定,计算噬菌体包装液 的滴度、cDNA文库的库容量及重组百分比;应用CVB_(3m)免疫的鼠多克隆抗血清 进行免疫学和地高辛标记核酸探针进行噬斑原位杂交筛选出阳性克隆,进一步用 PCR扩增2B基因鉴定筛选出的阳性克隆。结果:急性病毒性心肌炎乳鼠心肌标本 病理学检查均有不同程度的炎性细胞浸润、心肌出血、坏死;所构成的CVB_(3m)cDNA 文库的库容量为3.18×10~6重组子,噬菌体包装液滴度为1.59×10~7pfu/ml,重组 百分比为71%;免疫学筛选出4O个可能的阳性克隆;地高辛核酸探针进行噬斑杂 交筛选出8个阳性克隆;2B基因被扩增。结论:建成CVB_(3m)基因组全长cDNA文 库,筛选出了阳性克隆,扩增出2B基因;通过免疫血清、特异性探针及特异性引 物扩增证实已成功地构建了CVB_(3m)基因组全长cDNA分子。本研究结果将为阐明 CVB_(3m)毒株2B蛋白的毒力及其致病机理奠定基础。


知网文化
【相似文献】
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 庄木;谢丙炎;王晓武;方智远;;利用PVX侵染性载体分析CMV正义和反义2b基因间的相互作用[A];农业生物灾害预防与控制研究[C];2005年
2 吴志明;谢晓亮;温春秀;田伟;刘铭;;黄瓜花叶病毒丹参株系2b基因的克隆[A];第八届全国中药和天然药物学术研讨会与第五届全国药用植物和植物药学学术研讨会论文集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前3条
1 廖乾生;黄瓜花叶病毒2b基因及其与卫星RNA互作研究[D];浙江大学;2007年
2 倪晓华;人类基因PanK、Rab2B、NM23-H1B和VRK3的克隆和功能研究[D];复旦大学;2003年
3 周盛梅;苹果和草莓APETALA2同源基因的克隆以及皇家嘎啦苹果的转化[D];山东农业大学;2002年
中国硕士学位论文全文数据库 前6条
1 杨善志;柯萨奇B3m病毒基因组全长cDNA文库的构建及阳性克隆的筛选[D];安徽医科大学;2001年
2 许文明;无精症相关基因ZNF230的转录调控研究与UBE2B基因的突变筛查[D];四川大学;2004年
3 王利军;拟南芥atslA基因启动子和ats2B基因启动子的克隆及其功能分析[D];西北农林科技大学;2004年
4 智庆文;SBE2B基因的克隆、表达载体的构建及水稻遗传转化体系的建立[D];四川农业大学;2002年
5 王鹏;益心康对柯萨奇B3m病毒性心肌炎小鼠作用的实验研究[D];辽宁中医学院;2002年
6 沈宝明;干扰黄瓜花叶病毒(CMV)人工MicroRNAs的构建及其遗传转化[D];湖南农业大学;2011年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978