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HCMV潜伏感染老龄BALB/c小鼠病理学模型的建立

方草晖  
【摘要】:目的 本研究首次用HCMV AD169株感染BALB/c小鼠,建立HCMV AD169株潜伏感染的老龄BALB/c小鼠病理学模型,为HCMV潜伏感染及其再激活机制的研究提供一个实验平台,同时探讨HCMV IE及UL83基因在病毒潜伏及再激活中作为标志基因的可能性。方法 首先通过预实验从细胞水平和分子水平对病毒进行定量测定。(一)建立敏感可靠的检测病毒颗粒的定量方法:(1)用空斑形成试验测定病毒悬液中感染性HCMV颗粒数量;(2)从病毒悬液中提取DNA,采用实时荧光定量PCR检测病毒基因拷贝数。(3)分别用50μl 0.01、0.1、1和10PFU的病毒悬液感染HF细胞,观察HCMV特征性细胞致病变效应(CPE)。观察周期结束后,将所有细胞消化,提取mRNA,经RT-PCR检测HCMV IE转录产物。(二)取6~8周龄SPF(Specific Pathogen Free)级BALB/c小鼠24只,分为2组,每组12只,分别用1×10~7PFU/ml、1×10~5PFU/ml 2个剂量的病毒悬液腹腔注射小鼠,每只小鼠注射1ml。屏蔽系统内饲养观察1年后检测小鼠脑、肺组织中有无感染性病毒颗粒及其组织病理损害情况,确定建立潜伏感染的最佳病毒剂量。在预试验基础上,建立HCMV AD169株潜伏感染老龄BALB/c小鼠病理学模型:取6~8周龄SPF级BALB/c小鼠24只,实验组(A组)12只,腹腔注射1×10~5PFU/ml病毒悬液,每只1ml。阴性对照组(B组)12只,同时同样腹腔注射DMEM液1ml。经饲养观察1年后,各组小鼠半数(6只)处死,剩余一半(6只)进行免疫抑制干预,按150mg/kg的剂量给各组小鼠腹腔注射环磷酰胺,每隔6天注射一次,共 安徽医科大学硕卜学位论文 3次,诱导潜伏HCMV的再激活。在最后一次注射后的第6天宰杀小鼠。饲养期 间,观察小鼠一般行为。处死小鼠后,取小鼠血清检测HCMV特异性IgG抗体。 取脑及肺组织进行如下试验:(1)病毒分离:接种HF细胞,观察4一sw。按预试 验确定的敏感方法检测小鼠脑及肺组织中有无感染性病毒颗粒存在。(2) HE染色 观察小鼠脑及肺组织的病理改变。(3)用HCMV pp65蛋白多克隆抗体进行免疫荧 光检测小鼠脑及肺组织中 pp65蛋白的表达。(4)原位杂交定位检测HCMVIE及 UL83基因。(5)PCR及Rl’- PCR检测小鼠脑及肺组织中HCMV IE、UL83基因及 其相应的转录产物。(6)透射电镜下观察小鼠脑及肺组织的超微结构及病毒颗粒。 (7)实时荧光定量PCR检测小鼠脑及肺组织中的病毒载量。结果(一)建立了 高灵敏度的检测病毒颗粒的方法。当HCMV病毒悬液病毒量为3.5 x 107PFU/ml 时,基因组拷贝数为8.75 x logcoPies/ml。由此推算出IPFu病毒对应于250基因 拷贝数。将病毒悬液稀释后接种HF细胞,4w内观察到IPFU的病毒可使90%HF 细胞产生CPE,而0.01 PFU的病毒接种HF细胞后,没有CPE出现,提取所有染 毒细胞的mRNA,在0.01PFU一10PFU/ml的滴度下,均可以检测出HCMVIE转 录产物,这代表着HCMV处于复制状态,其检测的下限0.01PFU相当于2.5基因 组拷贝,而建立复制性感染最少需要1基因组拷贝。(二)lx107PFu/ml病毒悬液 感染小鼠后,肺组织中检测出感染性病毒颗粒,脑及肺组织均有明显的组织病理 学变化;1 x lo5PFu/ml病毒悬液感染小鼠后,脑、肺中检测不出感染性病毒颗粒 且无明显组织病理学变化。由此确定建立潜伏感染的最适感染剂量为IX 105PFU/ml。小鼠染毒1年后,各项检测结果如下:(l)病毒分离:激活前,各组 小鼠脑、肺组织病毒分离阴性;激活后,在A组小鼠的脑、肺组织中检出感染性 病毒颗粒,B组小鼠病毒分离结果阴性。(2) HE染色:激活前,A组小鼠肺部无 明显组织病理改变,脑部可见轻微神经元周围纤维样缠结。激活后可见肺泡壁增 厚、水肿,有明显急性炎症反应,可观察到巨细胞病毒特征性包涵体。脑组织中 神经元明显退行性变,神经元变性、坏死,周围纤维样缠结严重。(3)A组小鼠 激活前,在脑、肺组织中pp65荧光信号均阴性;激活后,在脑、肺组织中均可见 苹果绿色阳性荧光信号,主要位于胞质中。(4)用DIG标记的HCMVIE及UL83 安徽医科大学硕七学位论文 DNA寡核昔酸探针行原位杂交检测,A组小鼠激活前后在脑、肺组织中均可检测 到不同程度的蓝紫色阳性杂交信号。(5) PCR及RT-PCR检测小鼠脑、肺组织中 HCMVIE、UL83基因及其相应的转录产物:激活前,A组小鼠的脑、肺组织中均 测出HCMVIE及UL83 DNA,但其相应的转录产物为阴性。激活后,上述两种基 因及其相应的转录产物为阳性。B组小鼠所有结果均为阴性。(6)透射电镜下观察 激活前A组小鼠脑、肺组织中没有病毒颗粒,但部分亚细胞结构有损伤;激活后 可观察到典型的疤疹病毒样颗粒及病毒包涵体。(7)实时荧光定量PCR检测小鼠 脑及肺组织中的病毒载量:激活前A组小鼠脑、肺组织中病毒载量分别为294士 23eopies/10omg脑组织、9028士193 eopies/100mg肺组织;激活后A组小鼠脑、肺 组织中病毒载量分别为5104士176eopies/loomg脑组织、78152士8905eopies/100mg 肺组织。激活前后组织病毒载量差异有显著性。(尸0.01)。结论(一)我们首次 建立了HCMV AD169株潜伏感染的老龄BALB/。小鼠病理学模型,并提出此潜伏 感染模型的暂定工作定义: (l)小鼠腹腔感染病毒后饲养观察1年或1年以上; (2)血清学检测小鼠血清中HcMV特异性


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