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人骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞的实验研究

周德存  
【摘要】:目的:探讨体外培养、扩增人骨髓间充质干细胞(Human marrow mesenchymal stem cells, hMSC),定向分化为心肌细胞的实验条件。方法:1.随机抽取体1-5岁先天性心脏病儿童体外循环手术时经胸骨穿刺抽取胸骨骨髓,Percoll淋巴细胞分离液梯度密度离心分离获取单个核细胞,用含20%胎牛血清的DMEM培养基进行体外培养、扩增,然后用贴壁培养,分离得到骨髓间充质干细胞,加5-氮杂胞苷(5-Azacytidine)进行试诱导分化;培养2代的细胞进行DNA含量的测定,培养6、7代细胞进行细胞表面抗原的鉴定,如CD14、CD31、CD34、CD45、CD71、CD90,于培养的0、15、24、38d进行细胞计数。2.另外获取少量心肌组织,一部分进行免疫组化鉴定,一部分制成细胞悬液用DMEM培养基进行体外培养、扩增,观察细胞形态变化,并用电镜观察细胞超微结构。结果:骨髓单个核细胞培养3天后逐渐贴壁,并形成细胞克隆,9天左右细胞增殖速度明显加快,培养2代的细胞DNA含量的测定S期细胞占19.2%,细胞计数为:(4.56±0.14)×10~6、(3.21±0.35)×10~7、(5.23±0.19)×10~8、(7.32±0.56)×10~9。培养5代的细胞扩增倍数约为1600倍,体外培养6、7代的细胞CD14、CD31、CD34、CD45、CD71抗体呈阴性反应、CD90抗体阳性反应,加5-氮杂胞苷(5-Azacytidine)进行试诱导分化,电镜下未见到典型的心肌细胞结构;体外培养的心肌细胞至5、6代虽然仍具有心肌细胞超微结构,并可以被抗肌动蛋白、肌球蛋白、支架蛋白的单克隆抗体染色,但第4代以后细胞增殖速度变慢,细胞逐渐变形,第6代基本停止生长。结论:1.人骨髓间充质干细胞是一种具有多能性的干细胞,Percoll淋巴 安徽医科大学硕士(博士)学位论文 细胞分离液分离、培养可获得骨髓间充质干细胞,并且在体外可多次传代,长期 培养仍保持干细胞的特性,为hMSC进一步的应用提供良好的实验基础。2.人发 育阶段的心肌细胞,在有限的体外培养过程中,数目可扩增,其亚显微结构和成 份基本稳定,有可能作为自体心肌细胞移植的组织材料,并提供心肌细胞的鉴定 方法。


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