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大鼠胚脑皮层源性神经干细胞体外培养及增殖分化特点

任于果  
【摘要】:目的:建立大鼠胚脑皮层神经干细胞体外培养模型及鉴定技术;探讨其在表皮生长因子(EGF)作用下的增殖分化特性,为应用神经干细胞移植治疗神经疾病提供基础。 方法:取孕13.5-14.5天Sprague-Dawley(SD)大鼠的胚胎大脑皮层神经细胞,采用含有终浓度为20ng/ml有丝分裂源表皮生长因子(EGF)和1%B27的无血清高糖DMEM/F12培养基体外培养,筛选神经干细胞;Nestin免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞特异性标记;单细胞连续克隆实验及BrdU免疫标记证实神经干细胞自我增殖能力;诱导细胞分化,MAP-2及GFAP免疫标记了解细胞向神经元及神经胶质细胞的分化能力。 结果:(1) 孕13.5-14.5天SD大鼠胚脑皮层分离的神经干细胞体外悬浮培养4—5天有大量细胞球形成;制备成单细胞悬液贴壁培养4小时内nestin免疫细胞化学标记,鉴定结果90%以上呈阳性表达,证实此细胞神经干细胞属性;倍比稀释法单细胞连续克隆实验,观察一周内细胞生长,有形状规则的神经细胞球形成;BrdU掺入实验,85%的细胞核呈BrdU免疫染色阳性,提示此来源NSCs具有增殖能力;细胞悬液贴壁培养一周,MAP-2和GFAP免疫细胞化学染色检测,证实其可分化为神经元和神经胶质细胞。(2) 去除EGF后体外培养分离胎鼠皮层细胞,发现生长速度明显减慢,细胞24小时贴壁分化及死亡率明显增加;细胞球形成慢且形状不规则;所培养细胞在第四次传代时几乎完全死亡。(3) 无血清条件下神经干细胞诱导分化后约40%表达MAP-2,60%表达GFAP;在细胞悬液中加入10%FBS培养,发现细胞贴壁加快,分化速度亦迅速,一周后90%以上分化细胞表达GFAP,表达MAP-2的细胞不足10%。 结论:孕13.5—14.5d大鼠胚胎大脑皮层可分离培养出神经干细胞;并具有增殖、


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